Вазари сообщает, что художник происходил из аристократической семьи. Воспитанный в традициях Фоппы, Бернардо Дзенале и Амброджо Бергоньоне, он прошёл обучение в мастерской Леонардо. Его первое произведение «Воскресение Христа, святой Леонард и святая Лючия» выполнено в 1491 году совместно с Марко д'Оджоно для миланской церкви Сан-Джованни-сул-Муро. Был придворным художником Лодовико Моро и славился своими психологическими портретами.

Больтраффио умер в возрасте 49 лет и был похоронен на кладбище церкви Св. Паулы в Комито.

Историки искусства предполагают, что фигура Младенца на картине Леонардо да Винчи «Мадонна Литта» принадлежит кисти Джованни Антонио Больтраффио. Известны подготовительные рисунки Больтраффио, в точности воспроизводящие эту фигур