Вавилонский царь Валтасар описан в ветхозаветной книге пророка Даниила. На многолюдном пиру он велел принести золотую и серебряную посуду, которую его отец Навуходоносор взял из святилища иерусалимского храма. Царь приказал наполнить сосуды вином для своих вельмож, жен и наложниц. Когда свершилось это кощунство, вдруг появилась таинственная рука и начертала на стене странные слова: «Мене, мене, текел, упарсин». Даниил сказал царю, что они означают его гибель; предсказание сбылось в ту же ночь. На картине Рембрандта исследуется изумление и страх, усиленный еще и выплеснувшимся из священных сосудов вином, что тоже символично.
Удивляет сделанная на иврите надпись, особое расположение букв которой заставляет вспомнить о соседе Рембрандта еврее Манассе бен Исраэле, с которым, как известно, художник поддерживал отношения.
Большие полотна с театрализованными эффектами были популярны в Нидерландах при жизни Рембрандта. «Пир Валтасара» демонстрирует, как мастерски художник трактовал подобные темы.