Тимофей Андреевич (Тимолеон Карл фон) Нефф родился 2 октября 1804 года в усадьбе Пюсси Эстляндской губернии. Незаконнорождённый сын француженки-гувернантки Л.Ф. Нефф. Мать Карла, 19-летняя Фелиците Нефф, приехала из Франции в Российскую империю, чтобы учить французскому языку детей из состоятельных семей, служить гувернанткой. В начале 1820-х мальчик был усыновлен владельцем усадьбы Кюти Г.О. Зеге фон Мантейффелем, который принимал большое участие в воспитании и обучении будущего художника.
Первоначальные художественные навыки получил под руководством К. Ф. фон Кюгельхена, брал частные уроки живописи у пейзажиста Ф. де ля Троба и, возможно, А. Хагенса. В 1824–1825 учился в Академии художеств в Дрездене, по окончании которой отправился в Рим. Сблизился с художниками-назарейцами. Изучал коллекции музеев, в особенности искусство Рафаэля и других мастеров Высокого Возрождения. Занимался жанровой и пейзажной живописью. Из Рима возвратился в Эстляндию.
В Риме художник приобрел высокую покровительницу в лице Великой княгини Елены Павловны, по совету которой приехал в 1826 году в Петербург.
В 1827 переехал в Петербург. Писал портреты; основную часть заказчиков Неффа составляло англо-немецкое купечество, духовенство, военные и чиновники. Быстро приобрел репутацию первоклассного портретиста. Вскоре приобрел большую известность своими портретами и другими работами, в особенности после того, как получил звание придворного художника и был назначен состоять при Императорском Эрмитаже. Приблизительно тогда же Неффу был дан заказ на девять образов для готической церкви в Императорской даче Александрии в Петергофе, который он исполнил в 1834 году. В 1834 году за образа, написанные для церкви в Александрии, получил пожизненную пенсию от Императорского двора и звание придворного художника.

"Ангел молитвы", Государственный Русский музей
Картина была написана художником по заказу Императорской семьи. Бытует два мнения: лик Ангела художник писал с супруги Николая I Императрицы Александры Фёдоровны, либо с их дочери Марии. Ангел со свечой, несущий свет в ночи, был известен по всей стране: его изображение неоднократно тиражировалось в иллюстрированных изданиях того времени, его охотно писали церковные живописцы на стенах и сводах храмов, копировали различные художники, в их числе был и Василий Иванович Суриков.
В 1835–1836 совершил вторую поездку в Италию. Осенью 1837-го провел персональную выставку в собственной мастерской в Петербурге. Тимофей Андреевич Нефф был женат. Его супругой стала баронесса Луиза Каульбарс. Они заключили брак в 1837 году, и лето после свадьбы Нефф обычно проводил в Эстляндии. В браке родилось двое детей, сын и дочь.
В 1839 году за образа, выполненные для малой церкви Зимнего дворца, удостоен звания академика.

"Портрет молодой женщины" 1830 год, частная коллекция

«Молодая девушка с розой в волосах» (также известная как «Девушка с розой в волосах»), 1831 год, частная коллекция

«Две русские девушки в национальных костюмах», 1837 год, Государственный Русский музей, Петербург

"Две эстонские девушки" 1840 год, Государственный Русский музей

Утерянный автопортрет художника Тимофея Андреевича Неффа, 1940-е годы

"Портрет девушки в белом платье" 1840 год

«Купальщица», 1840 год,
Государственный Зрмитаж, Ст.-Петербург

«В восточном гареме», 1840 год
Частное собрание

"Мечтание", Государственная Третьяковская галерея, Москва

«Неаполитанский пастушок на берегу моря, освещенный восходящим солнцем», 1841
Государственная Третьяковская галерея, Москва
Летом 1842 года Нефф вновь предпринял путешествие в Италию.

"Девушка на фоне гор", частная коллекция

«Портрет детей Олсуфьевых», 1842 год
Козьмодемъянский художественно-исторический музей им. А.В.Григорьева

«Молодая мать с детьми на прогулке», 1843 год, Государственная Третьяковская галерея, Москва

«Два уличных итальянских мальчишки на крыше» (также известная под названиями «Итальянские беспризорные дети»), 1843 год, частная коллекция

«Итальянка» (или «Юная девушка»), 1844 год, Киевская картинная галерея
«Купальщица», 1844 год
Новгородский государственный объединенный музей-заповедник, Новгород

«Портрет леди Баррет из Белхаса», 1844 год, частная коллекция

«Портрет Великой княгини Марии Николаевны», написанный в 1846 году, Государственная Третьяковская галерея

«Великие княжны Ольга Николаевна и Мария Николаевна», 1848 год,
Государственный Русский музей

«Женщина с кувшином», 1855 год,
Государственный Русский музей, Ст.-Петербург

«Портрет неизвестной молодой дамы в голубом платье с ребёнком на руках», которая хранится в собрании Музея В. А. Тропинина и московских художников его времени

"Портрет дамы", хранится в Краснодарском краевом художественном музее имени Ф. А. Коваленко

"Богоматерь с младенцем" написанная в 1846 году специально для Исаакиевского собора в Петербурге, там и находится в настоящее время

"Богоматерь с младенцем", Исаакиевский собор, Ст.-Петербург

«Рождество Богородицы», 1846 год, Исаакиевский собор, Петербург

Мозаичная икона преподобного Исаакия Далматского в Исаакиевском соборе создавалась по оригиналу иконы Неффа с 1851 по 1856 год, Исаакиевский собор, Петербург
Осенью 1843 получил предписание возвратиться в Петербург для участия в росписи Исаакиевского собора, для которого создал образа нижнего ряда главного иконостаса и образа, помещенные в нишах столбов. За эту работу отмечен почетным дипломом Флорентийской Академии художеств. В 1844 получил русский дворянский титул. В 1849 удостоен звания профессора ИАХ. В 1855 принят на академическую службу «по живописи исторической и портретной», стал членом Совета ИАХ. В 1857–1858 снова совершил поездку в Италию. С 1864 исполнял должность хранителя картинной галереи Эрмитажа.

«Портрет герцогини Марии Максимилиановны Лейхтенбергской в детстве», 1846 год, Государственный Русский музей

«Эстонская женщина с ребенком», 1859 год, Эстонский художественный музей, Таллин
В последние десятилетия много работал в области монументальной живописи. Помимо работ в Исаакиевском соборе, выполнил композицию «Воскресение Христово» для церкви в селе Гулынки (1864), свыше двадцати икон для православной часовни в Ницце (1867), иконостас для церкви великой княгини Марии Александровны герцогини Эдинбургской в Лондоне (1875). В 1860–70-х работал над образами Храма Христа Спасителя в Москве, для которого создал 28 композиций для иконостасов боковых приделов и 31 — для главного иконостаса.

«Портрет Императрицы Марии Александровны», 1864 год, Государственный Исторический музей, Москва
В 1855 Нефф стал членом Совета Императорской Академии художеств. Был награжден рядом российских орденов. Почётный член Флорентийской Академии художеств.
Скончался 24 декабря 1876 года в Санкт-Петербурге, похоронен на Смоленском лютеранском кладбище.
Произведения Неффа находятся во многих музейных собраниях России, в том числе в Государственном Русском музее, Государственной Третьяковской галерее, Государственном Эрмитаже, в том числе в галерее Уффици во Флоренции и других, а так же в частных коллекциях.
