Молекулярные механизмы дидрогестерона (дюфастона)
Часть 1. Исследование селективности взаимодействия дидрогестерона с прогестероновыми рецепторами методами молекулярной механики

Акад. РАМН, дир. Г.Т. СУХИХ1, к.х.н., зав. лаб. И.Ю. ТОРШИН2,4, д.м.н., проф. О.А. ГРОМОВА3,4, асп. И.С. ЮРГЕЛЬ4, доц. С.А. ГАЛИЦКАЯ4
1Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва;
2РСЦ Института микроэлементов ЮНЕСКО,
3ВЦ РАН им. Дородницына, Москва;
4Ивановская государственная медицинская академия


На основе молекулярного моделирования и новейшего теоретического метода - метода энергетических молекулярных профилей белков изучали взаимодействие дидрогестерона и других прогестагенов с различными типами стероидных рецепторов. Результаты теоретического анализа молекулярных взаимодействий дидрогестерона подтверждают данные биохимии и экспериментальной фармакологиии и дают фундаментальное обоснование высокой селективности взаимодействий дидрогестерона на молекулярном уровне. Результаты позволяют предположить, что ключевым моментом высокой селективности дидрогестерона является уникальное для этой молекулы позиционирование метильной группы С19 при атоме С10 стероидного ядра. Высокая селективность дидрогестерона по отношению к прогестероновым рецепторам - основа эффективности и безопасности терапии.

Ключевые слова: гестагены, дидрогестерон, рецепторы, стероидные гормоны, молекулярные механизмы.

Прогестагены - один из пяти основных классов стероидных гормонов (рис. 1); остальные классы включают эстрогены, андрогены, минералокортикоиды, глюкокортикоиды. Хотя исходно прогестагены получили свое название ("про" - за и "гестация", т.е. вынашивание) будучи необходимыми для поддержания беременности, они также имеют и другие функции (например поддержка менструального цикла).

Рис. 1. Общая химическая структура стероидных гормонов (а) и нумерация атомов в молекулах стероидов (б).

Основное действие прогестагенов реализуется через взаимодействие со специальной разновидностью стероидных рецепторов - прогестероновыми рецепторами (см. далее). При связывании прогестагена молекулы прогестероновых рецепторов проникают внутрь ядра клетки и активируют процессы транскрипции сотен генов (более 1700 генов). Экспрессия этих генов активирует многочисленные физиологические механизмы: внутриклеточной передачи сигнала, энергетического метаболизма и др., приводящие в конечном итоге к поддержке состояния беременности и росту тканей плода.

Прогестагены отличаются по степени проявления побочных эффектов. Побочные эффекты прогестагенов возникают вследствие взаимодействия этих прогестагенов или их метаболитов с другими видами стероидных рецепторов: андрогеновыми, эстрогеновыми, минералокортикоидными и глюкокортикоидными рецепторами. Наиболее серьезные побочные эффекты возникают, когда некоторые прогестагены активируют андрогеновые и эстрогеновые рецепторы. Избыточная активация андрогенового рецептора может приводить к вирилизации плода. Избыточная активация эстрогенового рецептора также нарушает процессы развития плода и способствует феминизации плода. Как известно, гиперэстрогения ассоциирована с повышенной пролиферативной активностью клеток и увеличивает риск канцерогенеза. Избыточная активация эстрогеновых рецепторов некоторыми метаболитами прогестинов миметирует эффекты гиперэстрогении [1, 2].

Парадоксально, но в повышенном количестве даже "натуральный" прогестерон будет вызывать вышеупомянутые побочные эффекты. Дело в том, что прогестерон - основа синтеза всех остальных стероидов, и его метаболиты будут неизбежно активировать и андрогеновые, и эстрогеновые рецепторы [1]. Побочные эффекты при использовании высоких доз прогестерона неизбежны, и это актуальная проблема: ведь неофициально представители некоторых производителей прогестероновых препаратов рекомендуют дозировки 600-1000 мг/сут в нарушение всех фармакологических и этических норм.

Дидрогестерон (Дюфастон) - прогестаген, не обладающий андрогенными или эстрогенными свойствами. Хотя дидрогестерон сходен с эндогенным прогестероном по молекулярной структуре и фармакологическим свойствам, он эффективен при пероральном применении в более низких дозах. Область терапевтического применения дидрогестерона тесно связана с его физиологическим влиянием на эндометрий и на нейроэндокринную регуляцию функции яичников. Дидрогестерон применяют при нарушениях менструального цикла, дисфункциональных маточных кровотечениях, бесплодии, при риске прерывания беременности, эндометриозе и предменструальном синдроме.

После перорального приема дидрогестерон легко всасывается (биодоступность около 30%). Максимальная концентрация в крови достигается через 0,5-2,5 ч [1]. Дидрогестерон полностью метаболизируется до 20-дигидродидрогестерона - еще одного активного прогестагена. Важным моментом в фармакокинетике дидрогестерона является отсутствие 17-гидроксилирования, это одна из причин того, что препарат не обладает андрогенной активностью [2].

Молекулярная структура дидрогестерона близка к структуре прогестерона, но имеет три уникальные особенности [1]. В молекуле дидрогестерона атом водорода при атоме С9 находится в бета-положении (над плоскостью молекулы, черный треугольник на рис. 1, 2) [2], метильная группа при С19 при атоме С10 - в альфа-положении (под плоскостью молекулы, штрихованный треугольник на рис. 2), т.е. наоборот по сравнению с молекулярной структурой прогестерона. Кроме того, дидрогестерон имеет дополнительную двойную связь С6-С7 [3]. Эти детали химической структуры, отличающие дидрогестерон от прогестерона, и обусловливают, по всей видимости, повышенную активность при пероральном применении и метаболическую стабильность препарата Дюфастон.

Рис. 2. Молекулярная структура прогестерона, дидрогестерона и других прогестинов, исследованных в настоящей работе.


Штрих-пунктир - стандартное обозначение положения соответствующей группы под плоскостью молекулы. На рисунке отчетливо видны три описанных в тексте отличия между прогестероном и дидрогестероном.

Хотя упомянутые выше различия в структуре дидрогестерона и обусловливают его уникальные химические свойства, подробного изучения молекулярных механизмов воздействия, отличающих дидрогестерон от других прогестагенов, не проводилось. В настоящей работе впервые предпринята попытка детализировать эти молекулярные механизмы и выявить особенности взаимодействия дидрогестерона и ряда других прогестинов (прежде всего прогестерона) с различными видами белков-рецепторов стероидных гормонов. Исследование проведено на основе построения полноатомных моделей взаимодействия прогестинов с лигандсвязывающими доменами белков-рецепторов с последующим использованием метода энергетических молекулярных профилей [3, 4].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для анализа структур комплексов стероидных рецепторов с прогестинами (прогестерон, дидрогестерон, левоноргестрел, норэтистерон) использовался метод молекулярных энергетических профилей. Молекулярные энергетические профили являются новой концепцией в биоинформатике и биофизике белка и используются для определения аминокислотных остатков в структуре белка, которые обладают экстремальными (наиболее высокими или наиболее низкими) значениями энергии переноса боковой цепи из растворителя в белок (ΔGост). Остатки с экстремальными значениями ΔGост часто являются функционально важными остатками [3].

Молекулярный энергетический профиль представляет собой список ΔGост каждого остатка в белке.

Список упорядочен в соответствии с порядковыми номерами остатков в аминокислотной последовательности белка-рецептора или другого белка. Для данной трехмерной структуры белка значения ΔGост рассчитываются с использованием процедур классической молекулярной механики. Процедура расчета состоит из двух этапов: минимизации энергии молекулярной системы и собственно расчета ΔGост . Ниже приводится детальное описание этого вычислительного метода.

Минимизация энергии осуществляется посредством алгоритмической комбинации, включающей перемежающиеся стадии минимизации энергии посредством конъюгированных градиентов и коротких периодов молекулярной динамики. Подобного рода комбинация (названная "интерактивная оптимизация") позволяет избежать "застревания" системы в локальных минимумах. Интерактивная оптимизация является итеративной процедурой. Один цикл минимизации состоит из 50 ... 200 шагов минимизации конъюгированных градиентов, за которой следует 100 ... 1000 фс молекулярной динамики. Применение метода конъюгированных градиентов в молекулярной механике заключается в смещении каждого атома в направлении действующих на этот атом сил. Для молекулы из N атомов сила, действующая на каждый атом, определяется как , где Uполн - полная внутренняя энергия молекулярной системы, j=1..N. Для i-го шага минимизации по конъюгированным градиентам новые координаты каждого атома определяются как где Uполн молекулярной системы, содержащей N атомов, B ковалентных связей (связывающих термов), A угловых термов и T торсионных термов определяются как где (терм энергии j-й ковалентной связи), (терм энергии j-го углового изгиба двух ковалентных связей), (терм энергии вращения j-го диэдрального угла). Терм несвязывающих взаимодействий определяется как сумма электростатического и ван-дер-ваальсового термов . Электростатические взаимодействия описываются законом Кулона а ван-дер-ваальсовы - посредством потенциала Леннарда-Джонса . Силовые константы Kb, Kθ , Vm, равновесные значения связей и углов r0, α0, φ0, а также константы Ajk, Bjk определены в соответствии с потенциалом UFF. Значения частичных атомных зарядов qj, qk определены на основе потенциала AMBER, при составлении которого использовались квантово-механические расчеты.

Молекулярная динамика основана на втором законе Ньютона , Значения ускорений aj индивидуальных атомов находятся на основе Uполн (выше), а затем численно интегрируются с использованием алгоритма Верле. Скорости и координаты в следующий момент времени t + Δt: , Начальные скорости атомов были рандомизированы в соответствии с распределением Максвелла . Температура системы фиксировалась в соответствии с равенством . Для расчетов использовалась T=300K и e=1.

Расчет энергий переноса боковой цепи из растворителя в белок (ΔGост) производился на основе несвязывающего потенциала, определяемого на основании вышеприведенных уравнений молекулярной механики и терма энергии сольватации. Таким образом, ΔGост i-го аминокислотного остатка, состоящего из k атомов, равна В данном случае представляет собой разность между несвязывающей энергией взаимодействия атомов аминокислотного остатка со всеми атомами белка и энергией взаимодействия атомов внутри аминокислотного остатка определяется как , а где j=1...k соответствует суммированию по атомам i-го аминокислотного остатка. ΔΔGсольв вычислялась как разность между термами сольватации внутри и вне белка где δj - атомный сольватационный параметр, полученный на основании экспериментов по определению LogP в системе октанол-вода, a ΔSAj - изменение доступности поверхности растворителю при переносе остатка из вакуума в белок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате настоящего исследования были получены полноатомные пространственные модели комплексов различных прогестинов (прогестерон, дидрогестерон, левоноргестрел, норэтистерон) с лигандсвязывающими доменами стероидных рецепторов различных типов: прогестероновых, андрогеновых, эстрогеновых, минералокортикоидных и глюкокортикоидных. Затем был произведен расчет энергий связывания и были построены молекулярные энергетические профили. Было также исследовано влияние пертурбаций химической структуры дидрогестерона (см. ниже) на энергии связывания с различными рецепторами. Данные по рассчитанной энергии связывания были сопоставлены с экспериментально определенными относительными связывающими способностями различных прогестинов [2, 5, 6]. В последующих разделах данные расчетов предваряются краткими введениями по биологии соответствующего типа стероидных рецепторов.

Прогестероновый рецептор

Известные эффекты прогестерона, включая влияние на овуляцию и имплантацию яйцеклетки в матку, опосредуются через одноименные белки-рецепторы. Рецепторы прогестерона являются одной из разновидностей стероидных рецепторов. Все стероидные рецепторы характеризуются модульной структурой, включающей регуляторный домен, ДНК-связывающий домен и стероидсвязывающий домен.

Рецепторы прогестерона широко распространены во всем организме, в том числе в матке (эндометрии и миометрии) и в яичниках (желтое тело и гранулярные клетки в преовуляторной фазе и фазе желтого тела). В большинстве органов-мишеней экспрессия рецепторов прогестерона усиливается под влиянием эстрогена и ослабляется под влиянием самого прогестерона [7]. Иначе говоря, избыток прогестерона и препаратов на его основе включает механизм биологической защиты, проявляющийся как снижение плотности рецепторов к прогестерону.

Рецепторы прогестерона кодируются одним геном PGR (синоним NR3C3) и имеют две основные формы - А и В, различающиеся по молекулярной массе [8]. Обе формы производятся через транскрипцию одного и того же гена PGR через раздельные промотеры (части ДНК гена, опосредующие начало транскрипции гена). Форма В отличается от формы А присутствием в структуре рецептора дополнительного модульного домена, так называемой "функции активации транскрипции", расположенного слева от регуляторного домена [9]. Форма В рецептора приводит к пролиферации клеток, а форма А препятствует пролиферации клеток, вызванной рецептором типа А и рецепторами эстрогенов. Обе формы имеют одинаковый стероидсвязывающий домен, с которым и воздействуют прогестерон, дидрогестерон и другие прогестины.

В ходе настоящего исследования были построены пространственные модели комплексов лиганд - белок четырех различных прогестинов со стероид-связывающим доменом прогестеронового рецептора. Модели были созданы на основе PDB файла 3D90 посредством описанных выше процедур молекулярной механики, а затем проанализированы посредством расчета энергий связывания каждого прогестина с рецептором и путем анализа молекулярных энергетических профилей. Результаты расчетов энергий связывания приведены в табл. 1, структура комплекса дидрогестерон-рецептор - рис. 3, а, б, см. на цв. вклейке.

Рис. 3. Структура комплекса дидрогестерон-прогестероновый рецептор (стероидсвязывающий домен).


Молекула дидрогестерона показана в форме перекрывающихся сфер. а - общая структура; б - точки контакта (аминокислоты) дидрогестерона с гидрофобным "карманом" рецептора.

Как следует из табл. 1, существует корреляция между рассчитанными энергиями образования комплексов и найденными из биохимических экспериментов данными об относительном связывании. В целом относительное связывание увеличивается на ~30% на каждые 0,1 ккал/моль рассчитанной энергии связывания ΔG (коэффициент корреляции r=0,69;p<0,02). Следует отметить, что дидрогестерон характеризуется большим сродством к рецептору, чем прогестерон. На это указывают как значения энергии связывания (ΔΔGпрогестерон = -0,47 ккал/моль, ΔΔGдидрогестерон =-0,65 ккал/моль), так и данные по относительному связыванию.

Таблица 1. Энергии связывания прогестинов с прогестероновым рецептором (стероидсвязывающий домен)

Прогестин ΔG, ккал/моль ΔΔG, ккал/моль Относительное связывание,%
Свободная форма -28,4 - -
Прогестерон -28,9 -0,47 50
Дидрогестерон -29,1 -0,65 75
Левоноргестрел -29,2 -0,68 150
Норэтистерон -29,1 -0,65 75

Примечание. Здесь и в табл. 2-5: свободная форма рецептора - структура рецептора при отсутствии связанного лиганда. Чем выше относительное связывание, тем выше сродство к рецептору. Расчет был проведен на основе построенных моделей прогестин-рецептор. ΔG - энергия образования комплекса; ΔΔG - относительная энергия образования (энергия образования минус ΔG свободной формы рецептора).

Молекулярный энергетический профиль белка указывает на индивидуальный вклад каждой аминокислоты в стабильность структуры белка. Значения ΔGост>0 и ΔΔGост>0 (т.е. больше нуля) соответствуют дестабилизации остатком структуры белка (на рис. 4 это соответствует всплескам, направленным вверх), а значения меньше нуля - стабилизации структуры белка (на рис. 4 всплески, направленные вниз). Дифференциальный молекулярный энергетический профиль комплексов рецептора с прогестероном и дидрогестероном (см. рис. 4) позволил установить элементы структуры рецептора, отвечающие за различия в связывании прогестерона и дидрогестерона с прогестероновым рецептором (Asp-704, Asn-705, Asn-709, Lys-790). Достаточно неожиданно, что эти остатки находятся далеко (более 1 нм) от гидрофобного кармана. Это означает, что особенности химической структуры молекулы дидрогестерона приводят к комплексному изменению конформации стероидсвязывающего домена рецептора, т.е. к специфической адаптации всей структуры стероидсвязывающего домена рецептора к молекуле дидрогестерона.

Рис. 4. Разностный энергетический профиль для комплексов стероидов с прогестероновым рецептором (стероидсвязывающий домен).


ΔGост в комплексе прогестерон-рецептор вычитались из ΔGост комплекса дидрогестерон-рецептор. Здесь и далее - энергии измеряются в условных единицах - 0,0025 ккал/моль (по оси ординат); по оси абсцисс - номера аминокислотных остатков по нумерации стероидсвязывающего домена.

Рецептор андрогенов

Избыточная стимуляция рецепторов андрогенов - нежелательный побочный эффект применения некоторых гестагенов (прогестинов). Используемые во время беременности неселективные гестагены и их метаболиты, помимо прогестагенного эффекта, будут вызывать у плода повышенную вирилизацию. Дидрогестерон отличается почти от всех используемых препаратов гестагенов тем, что практически не вызывает андрогенных эффектов и не преобразуется в андрогенизирующие метаболиты. Это связано с тем, что дидрогестерон не приводит к активации рецептора андрогенов [10].

Рецептор андрогенов (ген NR3C4) активируется путем связывания андрогенных гормонов тестостерона и дигидротестостерона [11]. Гены, транскрипция которых регулируется рецептором андрогенов, отвечают прежде всего за формирование и поддержание мужского гендерного фенотипа. Андрогеновый рецептор активирует транскрипцию соответствующих генов, связываясь с особым участком ДНК, называемым "гормонреагирующим элементом". Известны две изоформы рецептора андрогенов - А и В [12]. Форма В рецептора имеет дополнительный домен подобно форме В прогестерон-рецептора. Обе формы рецептора имеют одинаковую структуру стероидсвязывающего домена.

В настоящей работе были построены пространственные модели комплексов лиганд-белок четырех прогестинов со стероидсвязывающим доменом рецептора андрогенов. Модели были построены на основе PDB файла 2Q7I. Результаты расчетов энергий связывания приведены в табл. 2.

Таблица 2. Энергии связывания тестостерона и прогестинов с рецептором андрогенов (стероидсвязывающий домен)

Прогестин ΔG, ккал/моль ΔΔG, ккал/моль Относительное связывание,%
Свободная форма -28,5 - -
Тестостерон -28,8 -0,31 100
Прогестерон -28,7 -0,21 -
Дидрогестерон -28,6 -0,12 -
Левоноргестрел -28,7 -0,18 45
Норэтистерон -28,6 -0,15 15

Данные табл. 2 показывают, что среди исследованных стероидов дидрогестерон имеет наибольшую энергию связывания с рецептором андрогенов (относительная энергия образования комплекса дидрогестерон-рецептор AAG=-0,12 ккал/моль). Это означает, что из всех исследованных стероидов дидрогестерон будет обладать наименьшей проандрогенной активностью. В самом деле, дидрогестерон не активирует андрогеновые рецепторы [2, 5, 6].

Анализ полученной модели структуры комплекса дидрогестерон-андрогеновый рецептор методом молекулярных энергетических профилей указал на особенности структуры рецептора, которые дестабилизируют взаимодействие рецептора с дидрогестероном (рис. 5, см. на цв. вклейке). Эти аминокислотные остатки (Arg-681, Asp-731, Lys-822, Arg854-Asp864), как и в случае с прогестероновым рецептором, расположены вдали от гидрофобного кармана рецептора, связывающего молекулу стероида, что также указывает на специфическую адаптацию всей структуры стероидсвязывающего домена рецептора к молекуле дидрогестерона. Однако в отличие от рецептора прогестерона это изменение конформации в районе остатков Arg-681, Asp-731, Lys-822, Arg854-Asp864 приводит к дестабилизации комплекса дидрогестерон-рецептор и, как следствие, к отсутствию активации андрогеновых рецепторов дидрогестероном.

Рис 5. Молекулярный энергетический профиль аминокислотных остатков андрогенового рецептора, дестабилизирующих взаимодействие с дидрогестероном.


а - молекулярный энергетический профиль (стероидсвязывающий домен); б - аминокислотные остатки, дестабилизирующие взаимодействие с дидрогестероном. Остатки располагаются в значительном удалении от гидрофобного кармана.

Эстрогеновый рецептор

Рецепторы эстрогена активируются основной формой эстрогенов - 17β-эстрадиолом [13]. Существуют два фундаментально различных вида рецепторов эстрогенов: рецепторы типа ER (гормон-рецепторы) и рецепторы типа GPR30, активирующие G-белки - внутриклеточные передатчики сигналов. В настоящем исследовании изучались взаимодействия стероидов с классическими рецепторами типа ER, которые опосредуют большинство биологических эффектов эстрогенов.

Рецепторы типа ER существуют в двух различных формах, ER-α и ER-β, каждая из которых кодируется отдельным геном (ESR1 и ESR2 соответственно). Форма ER-α чаще встречается в эндометрии, яичниках, клетках стромы и в гипоталамусе; форма ER-β - в почках, мозге, костях, сердце, легких, слизистой оболочке кишечника и эндотелии [14]. Две формы рецептора взаимодействуют друг с другом и образуют димеры трех различных типов: αα, ββ или αβ [15].

Обе формы эстрогенового рецептора имеют одинаковую структуру стероидсвязывающего домена, взаимодействия с которым и анализировались в настоящей работе. Расчет свободных энергий связывания для четырех исследованных прогестинов показал, что значения относительной энергии образования комплексов гестаген-рецептор были положительны (ΔΔG>0; табл. 3); для дидрогестерона значение составило ΔΔG=+0,35 ккал/моль. Положительные величины ΔΔG означают, что ни один из исследованных прогестагенов не будет образовывать ста-бильный комплекс с рецептором эстрогенов. Это находится в полном соответствии с результатами биохимических исследований, суммированных в работе [2].

Таблица 3. Энергии связывания эстрадиола и прогестинов с рецептором эстрогенов (стероидсвязываюший домен, модели на основе PDB 1qku)

Прогестин ΔG, ккал/моль ΔΔG, ккал/моль Относительное связывание,%
Свободная форма -29,2 - -
Прогестерон -29,0 0,22 -
Дидрогестерон -28,8 0,35 -
Левоноргестрел -28,4 0,82 -
Норэтистерон -28,6 0,62 -
Эстрадиол -29,5 -0,33 100

Минералокортикоидный рецептор

Минералокортикоидный рецептор (ген MLR) встречается в тканях многих органов (почки, толстая кишка, сердце, гиппокамп, коричневая жировая ткань, потовые железы), а также в эпителии. В последнем активация минералокортикоидного рецептора альдостероном приводит к синтезу белков, регулирующих минеральный обмен, транспорт Na+, и в основном увеличивает синтез эпителиальных натриевых каналов, что приводит к задержке жидкости, увеличению внеклеточного объема, пастозности и отечности, а также повышению артериального давления и усилению выведения калия с мочой. Рецептор активируется и другим минералокортикоидом - дезоксикортикостероном, глюкокортикоидами кортизолом и кортизоном [16] и, возможно, некоторыми прогестинами [17].

В настоящем исследовании были построены пространственные модели комплексов лиганд-белок со стероидсвязывающим доменом минералокортикоидного рецептора для четырех прогестинов. Результаты расчетов энергий связывания приведены в табл. 4, из которой видно, что среди исследованных стероидов дидрогестерон имеет наименьшую энергию связывания с рецептором (относительная энергия образования комплекса дидрогестерон-рецептор ΔΔG= -0,85 ккал/моль), в то время как энергия связи с основным агонистом рецепторов - альдостероном была гораздо выше: ΔΔG= -2,23 ккал/моль. Это означает, что из всех исследованных стероидов дидрогестерон с наименьшей вероятностью будет обладать минералокортикоидной активностью. В самом деле, дидрогестерон не активирует минералокортикоидные рецепторы [2-6]. Клинически, дидрогестерон не приводит к задержке жидкости и не увеличивает артериальное давление. Более того, применение смеси эстрадиола и дидрогестерона вызывало значительное снижение систолического давления у нормотензивных женщин после менопаузы [18].

Таблица 4. Энергии связывания альдостерона и прогестинов с минералокортикоидным рецептором (стероидсвязываюший домен, модели на основе PDB 2aa2)

Прогестин ΔG, ккал/моль [ΔG, ккал/моль Относительное связывание,%
Свободная форма -26,7 - -
Прогестерон -28,5 - 1,82 100
Дидрогестерон -27,5 -0,85 -
Левоноргестрел -28,3 - 1,57 70
Норэтистерон -28,5 - 1,77 -
Альдостерон -28,9 -2,23 100

Глюкокортикоидный рецептор

Глюкокортикоидный рецептор (ген NR3C1) является рецептором кортизола и других глюкокортикоидов. Кортизол обычно называют "гормоном стресса", так как он повышает артериальное давление и уровень сахара в крови, снижая при этом иммунный ответ. После активации глюкокортикоидный рецептор, как и другие стероидные рецепторы, димеризуется, перемещается в ядро клетки и там активирует транскрипцию соответствующих генов.

В настоящем исследовании были проведены расчеты энергий связывания прогестинов с глюкокортикоидным рецептором на основе полученных нами пространственных моделей комплексов лиганд- белок. Результаты расчетов энергий связывания приведены в табл. 5. Среди исследованных стероидов дидрогестерон имеет наименьшую энергию связывания с рецептором (относительная энергия образования комплекса дидрогестерон-рецептор ΔΔG= -0,19 ккал/моль). Таким образом, из всех исследованных стероидов дидрогестерон с наименьшей вероятностью будет обладать глюкокортикоидной активностью, что соответствует биохимическим данным [2-6].

Таблица 5. Энергии связывания кортизола и прогестинов с глюкокортикоидным рецептором (стероидсвязывающий домен, модели на основе PDB 1nhz)

Прогестин ΔG, ккал/моль ΔΔG, ккал/моль Относительное связывание,%
Свободная форма -27,9 - -
Прогестерон -28,2 -0,32 10
Дидрогестерон -28,1 -0,19 -
Левоноргестрел -28,3 -0,37 2
Норэтистерон -28,3 -0,38 -
Кортизол -28,6 -0,68 100

Пертурбация структурных особенностей молекулы дидрогестерона В настоящем исследовании термин "пертурбация" означает целенаправленное изменение химической структуры дидрогестерона с целью изучения влияния отдельных элементов этой структуры на связывание со стероидными рецепторами. Молекулярная структура дидрогестерона (см. рис. 2) близка к структуре прогестерона, но имеет уникальные особенности. В молекуле дидрогестерона атом водорода при атоме С9 стероидного ядра находится в бета-положении (условно говоря, над плоскостью молекулы, см. рис. 1), а метильная группа при С10 - в альфа-положении (т.е. под плоскостью молекулы). Кроме того, дидрогестерон имеет дополнительную двойную связь С6-С7. Эти различия химической структуры, по всей видимости, и обусловливают повышенную прогестероновую активность дидрогестерона (Дюфастон) при пероральном применении, метаболическую стабильность и отсутствие у дидрогестерона эстрогенных, андрогенных, глюкокортикоидных и минералокортикоидных свойств.

Представляет особый интерес, насколько важен вклад каждой из этих трех структурных особенностей молекулы дидрогестерона (положение метильной группы при С10, водорода при С9 и двойной связи С6-С7 (рис. 6) в энергии связывания со стероидными рецепторами. Для изучения этого вопроса были произведены частичные пертурбации структуры молекулы прогестерона с использованием вышеупомянутых особенностей структуры дидрогестерона. Иначе говоря, были построены модели с химическими вариантами прогестерона, которые включают только одну из этих трех структурных особенностей дидрогестерона.

Рис. 6. Структурные особенности, отличающие дидрогестерон от прогестерона и других прогестинов.

Результаты расчета энергий связывания с рецепторами, соответствующие каждой из структурных особенностей молекулы дидрогестерона, приведены в табл. 6. Так как андрогенные эффекты - основной побочный эффект применения некоторых прогестинов, сравнение проводилось на основе структур комплексов с лигандсвязывающими доменами прогестеронового и андрогенового рецепторов.

Как видно из табл. 6, наибольший вклад в энергию связывания с прогестероновым рецептором вносит альфа-положение метильной группы при С10 (ΔΔG=-0,06 ккал/моль, ~70% разницы в энергии). Именно альфа-положение метильной группы также имеет принципиальное значение для дестабилизации комплекса дидрогестерон-андрогеновый рецептор (ΔΔG= -0,07 ккал/моль, более 60% разницы в энергии). Таким образом, альфа-положение метильной группы - элемент структуры дидрогестерона, принципиально важный для высокой активности и специфичности действующего начала препарата Дюфастон.

Таблица 6. Энергетические вклады различных особенностей структуры дидрогестерона в энергию связывания с прогестероновым и андрогеновым рецепторами (стероидсвязывающие домены)

Особенность структуры ΔΔG, ккал/моль (прогестероновый рецептор) ΔΔG, ккал/моль (андрогеновый рецептор)
Метильная группа при С10 в альфа-положении -0,06 +0,07
Водород при С9 в бета-положении -0,02 +0,02
Двойная связь С6-С7 -0,01 +0,02

Примечание. Приведены значения относительных энергий образования комплексов (ΔΔG).

Заключение

Дидрогестерон - действующее начало препарата Дюфастон, используемого при невынашивании, нарушениях менструального цикла и предменструальном синдроме. Отличительной особенностью препарата является высокая селективность взаимодействия с прогестероновым рецептором. Это обусловливает практически полное отсутствие побочных эффектов, связанных с активацией других стероидных рецепторов - рецепторов андрогенов, минералокортикоидов, глюкокортикоидов и эстрогенов. В настоящем исследовании были проанализированы фундаментальные биофизические основы высокоспецифического действия дидрогестерона по отношению к рецепторам прогестерона. Показано, что дидрогестерон характеризуется одной из самых высоких способностью связывания с прогестероновым рецептором и самыми низкими возможностями связывания (или полным отсутствием связывания) с другими разновидностями стероидных рецепторов. Можно также предположить, что изменение конформации непрогестероновых рецепторов, вызываемое дидрогестероном, не соответствует активным конформациям этих рецепторов. Пертурбационный анализ структуры дидрогестерона в комплексе с прогестероновым и андрогеновым рецепторами показал, что альфа-положение метильной группы С19 при атоме углерода С10 является наиважнейшим фактором, определяющим высокую активность и специфичность дидрогестерона.

Следует отметить три важнейшие перспективы для дальнейших исследований дидрогестерона.

Во-первых, представляет интерес изучить различия в экспрессии генов, активируемых различными типами стероидных рецепторов. Это исследование проводится в настоящее время посредством полногеномного анализа сайтов связывания стероидных рецепторов. Результаты исследования позволят дать детальную характеристику различиям молекулярно-биологических механизмов действия дидрогестерона, прогестерона и других прогестинов.

Во-вторых, проведенные расчеты указывают на необходимость выполнения рентгеноструктурных исследований комплексов дидрогестерона и прогестерона с лиганд-связывающими доменами стероидных рецепторов. Несмотря на то что дидрогестерон известен уже более полувека, пространственных структур комплексов дидрогестерона с прогестероновым и другими рецепторами не было установлено. В то же время для гораздо менее значимых норэтистерона и левоноргестрела уже имеются структуры комплексов с различными рецепторами. Экспериментальное установление структур комплексов лекарство-белок - одна из основных характеристик любого препарата в современной молекулярной фармакологии и является своего рода "молекулярным паспортом" препарата. Экспериментальное установление структур комплексов белков с дидрогестероном на основе рентгеноструктурного анализа (и, если возможно, ядерно-магнитного резонанса) позволит не только подтвердить и существенно уточнить результаты настоящей работы, но и точно охарактеризовать активные и неактивные конформации стероидных рецепторов, указав тем самым на фундаментальные отличия дидрогестерона от других прогестинов.

В-третьих, представляет определенный интерес проведение сравнительных исследований связывания дидрогестерона и прогестерона с ферментами биосинтеза стероидов и с транспортными белками стероидов. Прогестерон - один из самых ранних продуктов преобразования холестерина и основа синтеза прочих стероидных гормонов. Путем последовательных биохимических трансформаций из прогестерона образуются андрогены, эстрогены, минералокортикоиды и глюкокортикоиды. Поэтому прогестерон из любого гормонального препарата обязательно будет трансформироваться в другие стероиды и неизбежно активировать соответствующие рецепторы. В то же время дидрогестерон вследствие особенностей химической структуры (прежде всего, как показал пертурбационный анализ, позиции метильной группы при С10) будет заведомо приводить к образованию низкоактивных производных веществ или даже предотвращать образование этих веществ. Эти производные дидрогестерона вместо активации других типов стероидных рецепторов будут приводить к блокированию всех типов стероидных рецепторов кроме прогестероновых и, следовательно, к высокоспецифичной активации прогестерон-рецепторов.

Транспортные белки, переносящие прогестерон и другие стероиды в организме, предотвращают рассеивание высокоактивных стероидов в кровяном русле и снижают скорость метаболического клиренса своих лигандов. Транспортные белки осуществляют функцию направленного транспорта стероидов и тем самым как бы усиливают гормональный сигнал. Поэтому исследование молекулярных основ взаимодействия прогестинов с транспортными белками стероидов представляет значительный интерес.

Описанные в настоящей работе молекулярные механизмы объясняют высокоспецифичное воздействие дидрогестерона (Дюфастон). С точки зрения практической медицины высокая специфичность взаимодействия дидрогестерона с прогестероновыми рецепторами имеет непреходящее значение. Недостаточность лютеиновой фазы - одна из основных причин невынашивания и нарушения менструального цикла. В настоящее время становится все более очевидным, что недостаточность лютеиновой фазы обусловлена не столько дефицитом гормона, сколько снижением чувствительности рецепторного аппарата эндометрия к воздействию прогестерона. Снижение чувствительности может быть связано с повреждением эндометрия и механическим удалением клеток эндометрия (и, следовательно, вместе с клетками прогестероновых рецепторов) при любых внутриматочных вмешательствах (диагностическое выскабливание, аборты, замершая беременность), инфекции и т.д. Высокоспецифичный дидрогестерон (Дюфастон) более эффективно активирует прогестероновые рецепторы и поэтому может быть использован даже при недостаточной чувствительности эндометрия.