Оригинал

НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Отчет по теме НИР №057 (1999 г.), стр.8-38; 232.

Плагиат

Докторская диссертация В.Н. Малашенко (2002 г.), стр. 111-121; 225-244.

Тему, план работы и отчет по НИР утверждал директор НИИ скорой помощи

Тему и план диссертации утверждал ученый совет Ярославской медакадемии

Экспериментальные исследования по теме НИР №057 выполняли сотрудники НИИ скорой помощи

Малашенко В.Н. не участвовал в экспериментальных исследованиях по теме НИР №057

Руководитель работы: Попова Т.С.

Научный консультант: Попова Т.С.

Научный консультант: Чумаков А.А.

4. Объект исследования

Объектом исследования служили 62 крысы-самца линии “Вистар” с массой тела 300-350г, которым после предварительной оперативной подготовки производилась трехсуточная обтурация общего желчного протока с последующей декомпрессией желчеотводящих протоков. В период декомпрессии в течение трех суток животным опытной группы проводили энтеральное питание смесью “Нутризон”, обогащенный глутамином. Животным контрольной группы на фоне декомпрессии проводилось энтеральное питание питательной смесью “Нутризон”, обогащенный аминокислотной смесью “Аминоплазмаль-10%”.

2.1.1. Объект исследования

Объектом исследования служили 62 крысы-самца линии “Вистар” с массой тела 300-350г, которым после предварительной оперативной подготовки производилась трехсуточная обтурация общего желчного протока с последующей декомпрессией желчеотводящих протоков. В период декомпрессии в течение трех суток животным опытной группы проводили энтеральное питание смесью “Нутризон”, обогащенный глутамином. Животным контрольной группы на фоне декомпрессии проводилось энтеральное питание питательной смесью “Нутризон”, обогащенный аминокислотной смесью “Аминоплазмаль-10%”.

5. Методы исследования

Операционная подготовка

Исследования выполнялись на половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 300 - 350 г, которые содержались на полноценном рационе из натуральных продуктов. Предварительная оперативная подготовка у 54 крыс включала: установку катетера в общем желчном протоке, вживление зонда в двенадцатиперстную кишку, вживление зонда в желудок, у 8 крыс дополнительно проводилось вживление платиновых игольчатых электродов в стенку тощей кишки в 5 см дистальнее связки Трейца. Операции выполняли под общим гексеналовым наркозом, для чего использовали 5% раствор гексенала, который вводили крысам внутрибрюшинно из расчета 0,3 мл на 100 г массы тела.

Катетер для желчного протока, кишечный и желудочный зонды были сделаны из полиэтиленовой трубки с наружным диаметром 1 мм. Конструкция желудочного и кишечного зонда представлена на рис. 1.

Электродное устройство для электрофизиологических исследований состоит из корпуса и смонтированных в нем двух игольчатых электродов, к которым припаяны электроизолированные провода с выходом последних за пределы корпуса (рис.2). Фиксация электродного устройства на кишке осуществляется с помощью запорного элемента в форме пластинки, плотно надеваемой на свободные концы игольчатых электродов. При таком способе фиксации устройства представлялось возможным обойтись без наложения фиксирующих лигатур и тем самым избежать нежелательного дополнительного травмирования кишки. Электроизолированные провода во время операции выводились из организма наружу и на время регистрации электрической активности тонкого кишечника соединялись с регистрирующей аппаратурой.

После фиксации в соответствующих органах желчный катетер, кишечный и желудочный зонды, а также провода от электродов проводили через мягкие ткани брюшной стенки и тазовой области и затем с помощью специального инструмента протаскивали под кожей хвоста и выводили наружу в 5-6 см от его кончика. Наружные концы желчного катетера и кишечного зонда соединяли с помощью трубчатой муфточки, что предотвращало потерю желчи и обеспечивало ее поступление непосредственно в двенадцатиперстную кишку (рис.3).

После операций крысы содержались в металлических (из нержавеющей стали) индивидуальных клетках оригинальной конструкции на специальной привязи, позволявшей животным передвигаться в пределах клетки (рис. 4). Клетки открыты сверху и расположены в ряд на близком расстоянии друг от друга, что позволяло крысам в смежных клетках общаться друг с другом (рис. 5). Конструктивные особенности клеток и способ содержания в них крыс во время эксперимента обеспечивали проведение необходимых манипуляций и процедур без причинения животным боли и иных нежелательных побочных воздействий, которые могли бы отрицательно повлиять на результаты исследования.

Для энтерального зондового питания крыс и введения глутамина использовали специальную установку - трофостат (рис. 6).

В помещении, в котором содержались животные, поддерживалась температура воздуха на уровне 22-24°С и обеспечивался суточный цикл освещенности с чередованием 12-часовых периодов света и темноты.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Операционная подготовка

Исследования выполнялись на половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 300 - 350 г, которые содержались на полноценном рационе из натуральных продуктов. Предварительная оперативная подготовка у 54 крыс включала: установку катетера в общем желчном протоке, вживление зонда в двенадцатиперстную кишку, вживление зонда в желудок, у 8 крыс дополнительно проводилось вживление платиновых игольчатых электродов в стенку тощей кишки в 5 см дистальнее связки Трейца. Операции выполняли под общим гексеналовым наркозом, для чего использовали 5% раствор гексенала, который вводили крысам внутрибрюшинно из расчета 0,3 мл на 100 г массы тела.

Катетер для желчного протока, кишечный и желудочный зонды были сделаны из полиэтиленовой трубки с наружным диаметром 1 мм. Конструкция желудочного и кишечного зонда представлена на рис. 1.

Электродное устройство для электрофизиологических исследований состоит из корпуса и смонтированных в нем двух игольчатых электродов, к которым припаяны электроизолированные провода с выходом последних за пределы корпуса (рис.2). Фиксация электродного устройства на кишке осуществляется с помощью запорного элемента в форме пластинки, плотно надеваемой на свободные концы игольчатых электродов. При таком способе фиксации устройства представлялось возможным обойтись без наложения фиксирующих лигатур и тем самым избежать нежелательного дополнительного травмирования кишки. Электроизолированные провода во время операции выводились из организма наружу и на время регистрации электрической активности тонкого кишечника соединялись с регистрирующей аппаратурой.

После фиксации в соответствующих органах желчный катетер, кишечный и желудочный зонды, а также провода от электродов проводили через мягкие ткани брюшной стенки и тазовой области и затем с помощью специального инструмента протаскивали под кожей хвоста и выводили наружу в 5-6 см от его кончика. Наружные концы желчного катетера и кишечного зонда соединяли с помощью трубчатой муфточки, что предотвращало потерю желчи и обеспечивало ее поступление непосредственно в двенадцатиперстную кишку (рис.3).

После операций крысы содержались в металлических (из нержавеющей стали) индивидуальных клетках оригинальной конструкции на специальной привязи, позволявшей животным передвигаться в пределах клетки (рис. 4). Клетки открыты сверху и расположены в ряд на близком расстоянии друг от друга, что позволяло крысам в смежных клетках общаться друг с другом (рис. 5). Конструктивные особенности клеток и способ содержания в них крыс во время эксперимента обеспечивали проведение необходимых манипуляций и процедур без причинения животным боли и иных нежелательных побочных воздействий, которые могли бы отрицательно повлиять на результаты исследования.

Для энтерального зондового питания крыс и введения глутамина использовали специальную установку - трофостат (рис. 6).

В помещении, в котором содержались животные, поддерживалась температура воздуха на уровне 22-24°С и обеспечивался суточный цикл освещенности с чередованием 12-часовых периодов света и темноты.

Условия проведения опытов

В продолжение всего эксперимента животные содержались на зондовом внутрижелудочном питании - непрерывно и круглосуточно крысам внутрижелудочно вводили питательную смесь Нутризон (Голландия). Опыты начинали проводить через 7-10 дней после вышеуказанных операций. За 18 часов до эксперимента из клеток убирали корм, но сохранялся свободный доступ крыс к воде. С целью воспроизведения обтурационного холестаза у необездвиженных и ненаркотизированных животных, разъединяли кишечный зонд и желчный катетер, а затем последний на 3-е сутки закрывали пробкой. По прошествии этого срока всем крысам опытной и контрольной групп производили декомпрессию желчевыводящих путей, для чего пробку из желчного катетера удаляли и с помощью трубчатой муфточки вновь восстанавливали ток желчи в двенадцатиперстную кишку. В течение последующих трех суток крысам опытной группы (27 крыс) в энтерально вводимую смесь Нутризон добавляли глутамин, содержание которого в питательной смеси равнялось 2% (1,3 г на крысу в сутки). Крысам контрольной группы (27 крыс) в энтерально вводимую смесь Нутризон добавляли аминокислотную смесь (Аминоплазмаль - 10%), не содержащую глутамин из расчета 1,3 г аминокислот на крысу в сутки. На всех этапах эксперимента производили взвешивание крыс.

По прошествии трех суток периода декомпресссии желчевыводящих путей и энтерального зондового питания крыс забивали декапитацией и у них забирали для последующего исследования кровь, печень, участки кишечника.

2.2.2. Условия проведения опытов

В продолжение всего эксперимента животные содержались на зондовом внутрижелудочном питании - непрерывно и круглосуточно крысам внутрижелудочно вводили питательную смесь Нутризон (Голландия). Опыты начинали проводить через 7-10 дней после вышеуказанных операций. За 18 часов до эксперимента из клеток убирали корм, но сохранялся свободный доступ крыс к воде. С целью воспроизведения обтурационного холестаза у необездвиженных и ненаркотизированных животных, разъединяли кишечный зонд и желчный катетер, а затем последний на 3-е сутки закрывали пробкой. По прошествии этого срока всем крысам опытной и контрольной групп производили декомпрессию желчевыводящих путей, для чего пробку из желчного катетера удаляли и с помощью трубчатой муфточки вновь восстанавливали ток желчи в двенадцатиперстную кишку. В течение последующих трех суток крысам опытной группы (27 крыс) в энтерально вводимую смесь Нутризон добавляли глутамин, содержание которого в питательной смеси равнялось 2% (1,3 г на крысу в сутки). Крысам контрольной группы (27 крыс) в энтерально вводимую смесь Нутризон добавляли аминокислотную смесь (Аминоплазмаль - 10%), не содержащую глутамин из расчета 1,3 г аминокислот на крысу в сутки. На всех этапах эксперимента производили взвешивание крыс.

По прошествии трех суток периода декомпресссии желчевыводящих путей и энтерального зондового питания крыс забивали декапитацией и у них забирали для последующего исследования кровь, печень, участки кишечника.

Биохимические исследования

Биохимические исследования проводились с использованием стандартных наборов реактивов промышленного производства. В плазме крови определяли активность g-глутамилтранспептидазы (g-ГТП), аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланиламинотрансферазы (АЛТ), лейцинаминопептидазы (ЛАП) и a-амилазы. В слизистой оболочке разных отделов тонкого кишечника определяли активность ЛАП и амилазы. В печени определяли активность ЛАП. В желчи определяли содержание холевой кислоты и билирубина, а также активность ЛАП. В поджелудочной железе определяли активность a-амилазы. Все исследования выполнялись микрометодом.

Результаты исследований активности кишечных ферментов представлялись в виде средних арифметических (М) и величины среднеквадратичной ошибки (+m). Статистическая обработка данных проводилась с помощью рангового критерия Манна-Уитни и считалась достоверной при Р равном или меньше 0,05.

2.2.3. Биохимические исследования

Биохимические исследования проводились с использованием стандартных наборов реактивов промышленного производства. В плазме крови определяли активность g-глутамилтранспептидазы (g-ГТП), аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланиламинотрансферазы (АЛТ), лейцинаминопептидазы (ЛАП) и a-амилазы. В слизистой оболочке разных отделов тонкого кишечника определяли активность ЛАП и амилазы. В печени определяли активность ЛАП. В желчи определяли содержание холевой кислоты и билирубина, а также активность ЛАП. В поджелудочной железе определяли активность a-амилазы. Все исследования выполнялись микрометодом.

Результаты исследований активности кишечных ферментов представлялись в виде средних арифметических (М) и величины среднеквадратичной ошибки (+m). Статистическая обработка данных проводилась с помощью рангового критерия Манна-Уитни и считалась достоверной при Р равном или меньше 0,05.

Регистрация и анализ электрической активности кишечника

Для записи электрической активности электроды подсоединялись к усилителю с чувствительностью 0,1 мВ. Записи производились в широкой полосе частот 0.017-200 Гц. Выходной сигнал поступал в компьютер IBM PC AT.

Сначала осуществлялся визуальный анализ электромиограмм - подсчитывались временные параметры электрической активности, которые позволяли характеризовать продолжительность мигрирующего миоэлектрического комплекса (ММК) и длительность фазы III. Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности проводилась с помощью комплекса программ, разработанных в лаборатории математического моделирования НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Данный комплекс программ включал в себя спектральный анализ и алгоритм нелинейной фильтрации сигналов. Спектральный анализ на основе алгоритмов преобразования Фурье использовался для оценки медленных волн. Подсчитывались параметры, характеризующие медленные волны: наиболее характерная частота для тощей кишки (в Гц); энергия спектра на этой частоте (в мВ). Алгоритм нелинейной фильтрации использовался для оценки потенциалов действия. Производился подсчет площади преобразованной электромиограммы, что позволяло оценить среднюю интенсивность генерации потенциалов действия.

2.2.4. Регистрация и анализ электрической активности кишечника

Для записи электрической активности электроды подсоединялись к усилителю с чувствительностью 0,1 мВ. Записи производились в широкой полосе частот 0.017-200 Гц. Выходной сигнал поступал в компьютер IBM PC AT.

Сначала осуществлялся визуальный анализ электромиограмм - подсчитывались временные параметры электрической активности, которые позволяли характеризовать продолжительность мигрирующего миоэлектрического комплекса (ММК) и длительность фазы III. Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности проводилась с помощью комплекса программ, разработанных в лаборатории математического моделирования НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Данный комплекс программ включал в себя спектральный анализ и алгоритм нелинейной фильтрации сигналов. Спектральный анализ на основе алгоритмов преобразования Фурье использовался для оценки медленных волн. Подсчитывались параметры, характеризующие медленные волны: наиболее характерная частота для тощей кишки (в Гц); энергия спектра на этой частоте (в мВ). Алгоритм нелинейной фильтрации использовался для оценки потенциалов действия. Производился подсчет площади преобразованной электромиограммы, что позволяло оценить среднюю интенсивность генерации потенциалов действия.

6. Полученные результаты

Влияние глутамина на печеночную недостаточность

5.1. Влияние механической желтухи, декомпрессии желчных путей и энтеральной терапии с глутамином на печеночную недостаточность

На первом этапе выполнения исследований по оценке эффективности включения глутамина в состав энтерально вводимых питательных смесей на устранение проявлений печеночной недостаточности при экспериментальном воспроизведении холестаза была проведена оценка степени поражения печени при полной 3-х суточной обтурации желчного протока.

Было установлено, что нарушение оттока желчи (внепеченочный холестаз) характеризовался развитием клинической картины механической желтухи практически у всех подопытных животных. У большинства из них желтуха проявлялась желтой окраской кожных покровов, слизистых оболочек, мочи. Основными показателями проявления холестаза служил высокий уровень билирубина (303±30,7), превосходящий исходное значение до обтурации почти в 3 раза (табл. 1).

На первом этапе выполнения исследований по оценке эффективности включения глутамина в состав энтерально вводимых питательных смесей на устранение проявлений печеночной недостаточности при экспериментальном воспроизведении холестаза была проведена оценка степени поражения печени при полной 3-х суточной обтурации желчного протока.

Было установлено, что нарушение оттока желчи (внепеченочный холестаз) характеризовался развитием клинической картины механической желтухи практически у всех подопытных животных. У большинства из них желтуха проявлялась желтой окраской кожных покровов, слизистых оболочек, мочи. Основными показателями проявления холестаза служил высокий уровень билирубина (303±30,7), превосходящий исходное значение до обтурации почти в 3 раза (табл. 16).

Известно, что желчные кислоты (или их соли) являются основным органическим компонентом желчи. Желчные кислоты поступают в желчь двумя путями - первичные желчные кислоты (холевая и хенодезоксихолевая), образуются из холестерина в печени; вторичные желчные кислоты (дезоксихолевая, литохолевая и урсодезоксихолевая) образуются под действием кишечных бактерий из первичных желчных кислот. В условиях наших экспериментов определялось содержание холевой кислоты, чрезвычайно важного субстрата для стабилизации физико-химического состояния желчи, а также переваривания и всасывания жиров. Было установлено (табл. 1), что через 3-е суток обтурации желчного протока концентрация холевой кислоты снижается почти в 3 раза, достигая 144±8,85 мкМ/л.

Важное значение в оценке степени проявления печеночной недостаточности уделяется определению активности АСТ, АЛТ. Известно, что повышение уровня АСТ и АЛГ в крови отражает степень острого повреждения гепатоцитов при токсическом лекарственном, вирусном и ишемическом гепатите. В наших наблюдениях (табл. 2) через 3-е суток обтурации увеличение содержания обнаружено лишь в отношении АСТ, при этом увеличивается соотношение АСТ/АЛТ. Такой характер изменения соотношения ферментов более часто обнаруживается при холестатическом синдроме, чем при гепатоцеллюлярных поражениях. Важными маркерами холестаза являются содержание в плазме крови gГТП и сывороточной лейцинаминопептидазы (ЛАП). Увеличение содержания gГТП и ЛАП свидетельствует о гепатобилиарном поражении и совпадает с повышением активности щелочной фосфатазы.

Известно, что желчные кислоты (или их соли) являются основным органическим компонентом желчи. Желчные кислоты поступают в желчь двумя путями - первичные желчные кислоты (холевая и хенодезоксихолевая), образуются из холестерина в печени; вторичные желчные кислоты (дезоксихолевая, литохолевая и урсодезоксихолевая) образуются под действием кишечных бактерий из первичных желчных кислот. В условиях наших экспериментов определялось содержание холевой кислоты, чрезвычайно важного субстрата для стабилизации физико-химического состояния желчи, а также переваривания и всасывания жиров. Было установлено (табл. 1), что через 3-е суток обтурации желчного протока концентрация холевой кислоты снижается почти в 3 раза, достигая 144±8,85 мкМ/л. (табл. 16).

Важное значение в оценке степени проявления печеночной недостаточности уделяется определению активности АСТ, АЛТ. Известно, что повышение уровня АСТ и АЛГ в крови отражает степень острого повреждения гепатоцитов при токсическом лекарственном, вирусном и ишемическом гепатите. В наших наблюдениях через 3-е суток обтурации увеличение содержания обнаружено лишь в отношении АСТ, при этом увеличивается соотношение АСТ/АЛТ (табл. 17). Такой характер изменения соотношения ферментов более часто обнаруживается при холестатическом синдроме, чем при гепатоцеллюлярных поражениях. Важными маркерами холестаза являются содержание в плазме крови gГТП и сывороточной лейцинаминопептидазы (ЛАП). Увеличение содержания gГТП и ЛАП свидетельствует о гепатобилиарном поражении и совпадает с повышением активности щелочной фосфатазы.

В целом анализ изменения исследуемых метаболических параметров и маркеров печеночной недостаточности в крови выявил наличие угнетения функциональной способности печени, обусловленной обтурацией общего желчного протока.

После 3-х суточной обтурации в течение 3-х суток проводилась декомпрессия желчных протоков посредством соединения желчного катетера с зондом, расположенным в 12-перстной кишке. Одновременно осуществлялось энтеральное питание смесью “Нутризон”, обогащенной глутамином в основной группе и с добавлением раствора аминокислот, не содержащего глутамина, в контрольной. Сочетанная терапия обнаруживала однонаправленное изменение изучаемых препаратов.

Положительное влияние проводимой терапии проявлялось в обеих группах достоверным снижением содержания билирубина и повышением содержания холевой кислоты в желчи (табл.1), что служило бесспорным доказательством разрешения холестаза.

В отношении активности таких ферментов как маркеры повреждения гепатоцитов (АСТ, АЛТ, АСТ/АЛТ) и маркеров холестаза (gГТП и ЛАП), хотя и была обнаружена общая тенденция к нормализации их содержания в плазме крови, сколь-нибудь значимых достоверных отличий влияния глутамина на эти процессы не обнаружено.

В целом анализ изменения исследуемых метаболических параметров и маркеров печеночной недостаточности в крови выявил наличие угнетения функциональной способности печени, обусловленной обтурацией общего желчного протока.

После 3-х суточной обтурации в течение 3-х суток проводилась декомпрессия желчных протоков посредством соединения желчного катетера с зондом, расположенным в 12-перстной кишке. Одновременно осуществлялось энтеральное питание смесью “Нутризон”, обогащенной глутамином в основной группе и с добавлением раствора аминокислот, не содержащего глутамина, в контрольной. Сочетанная терапия обнаруживала однонаправленное изменение изучаемых препаратов.

Положительное влияние проводимой терапии проявлялось в обеих группах достоверным снижением содержания билирубина и повышением содержания холевой кислоты в желчи (табл.1), что служило бесспорным доказательством разрешения холестаза.

В отношении активности таких ферментов как маркеры повреждения гепатоцитов (АСТ, АЛТ, АСТ/АЛТ) и маркеров холестаза (gГТП и ЛАП), хотя и была обнаружена общая тенденция к нормализации их содержания в плазме крови, сколь-нибудь значимых достоверных отличий влияния глутамина на эти процессы не обнаружено.

5.2. Влияние механической желтухи, декомпрессии желчных путей и энтеральной терапии с глутамином на ферментативную активность тонкой кишки

Исходное исследование активности адсорбированной a-амилазы в различных отделах тонкой кишки выявило четко выраженный проксимо-дистальный градиент со снижением концентрационных показателей от  двенадцатиперстной кишки к подвздошной соответственно с 118±21 до 7,19±1,83 Е/г (табл. 3).

Для исходных концентраций собственного кишечного фермента ЛАП характерна другая закономерность, наличие дистально-проксимального градиента со снижением концентрации  с 2,09±0,40 до 0,804±0,075 Е/г от подвздошной к двенадцатиперстной кишке.

На высоте обтурации на 3-и сутки активность a-амилазы существенно снижалась во всех исследуемых отделах более чем в 2 раза (р<0,01). 

Выполненная в течение 3-х последующих суток декомпрессия желчных путей в сочетании с энтеральным питанием позволила выявить выраженное, более, чем в 2 раза повышение содержания a-амилазы в 12-перстной кишке при добавке к смеси “Нутризон” глутамина, в то время как в контрольной серии крыс эти изменения в отношении 12-перстной кишки практически не были существенными. Следует заметить, что содержание a-амилазы в тонкой и подвздошной кишке было резко сниженным и не изменялось в результате декомпрессии и энтерального питания.

При оценке влияния глутамина на кишечный фермент ЛАП следует констатировать отсутствие выраженных изменений как в результате 3-х суточной обтурации общего желчного протока, так и после декомпресии и энтерального питания. Достоверное снижение концентрации ЛАП после введения в составе энтерального питания глутамина было отмечено лишь в подвздошной кишке.

В целом влияние глутамина на активность ферментов в слизистой тонкого кишечника проявлялось неоднозначно, хотя преобладал положительный эффект.

5.2. Влияние механической желтухи, декомпрессии желчных путей и энтеральной терапии с глутамином на ферментативную активность тонкой кишки

Исходное исследование активности адсорбированной a-амилазы в различных отделах тонкой кишки выявило четко выраженный проксимо-дистальный градиент со снижением концентрационных показателей от  двенадцатиперстной кишки к подвздошной соответственно с 118±21 до 7,19±1,83 Е/г (табл. 18).

Для исходных концентраций собственного кишечного фермента ЛАП характерна другая закономерность, наличие дистально-проксимального градиента со снижением концентрации  с 2,09±0,40 до 0,804±0,075 Е/г от подвздошной к двенадцатиперстной кишке.

На высоте обтурации на 3-и сутки активность a-амилазы существенно снижалась во всех исследуемых отделах более чем в 2 раза (р<0,01). 

Выполненная в течение 3-х последующих суток декомпрессия желчных путей в сочетании с энтеральным питанием позволила выявить выраженное, более, чем в 2 раза повышение содержания a-амилазы в 12-перстной кишке при добавке к смеси “Нутризон” глутамина, в то время как в контрольной серии крыс эти изменения в отношении 12-перстной кишки практически не были существенными. Следует заметить, что содержание a-амилазы в тонкой и подвздошной кишке было резко сниженным и не изменялось в результате декомпрессии и энтерального питания.

При оценке влияния глутамина на кишечный фермент ЛАП следует констатировать отсутствие выраженных изменений как в результате 3-х суточной обтурации общего желчного протока, так и после декомпресии и энтерального питания. Достоверное снижение концентрации ЛАП после введения в составе энтерального питания глутамина было отмечено лишь в подвздошной кишке.

В целом влияние глутамина на активность ферментов в слизистой тонкого кишечника проявлялось неоднозначно, хотя преобладал положительный эффект.

Электрофизиологические исследования

Электрическая активность тонкой кишки здоровых крыс

У 8 здоровых крыс производилась запись электрической активности тонкой кишки при 18-ти часовой пищевой депривации. Длительность записей составляла 1 час.

Исследование электрической активности тонкой кишки в норме показало, что интенсивность генерации потенциалов действия составляла 3,42±0,94 у.е. (табл. 4). У всех крыс в голодном состоянии регистрировался регулярный мигрирующий миоэлектрический комплекс (ММК), состоящий из трех фаз - фазы I - покоя, фазы II - нерегулярной активности и фазы III - регулярной (ритмической) активности (рис. 7).

Период ММК составлял от 585 до 625 сек. Продолжительность фазы III - около 210 сек. Процент времени активности - 40%.

5.4. Электрофизиологические исследования

5.4.1. Электрическая активность тонкой кишки здоровых крыс

У 8 здоровых крыс производилась запись электрической активности тонкой кишки при 18-ти часовой пищевой депривации. Длительность записей составляла 1 час.

Исследование электрической активности тонкой кишки в норме показало, что интенсивность генерации потенциалов действия составляла 3,42±0,94 у.е. (табл. 20). У всех крыс в голодном состоянии регистрировался регулярный мигрирующий миоэлектрический комплекс (ММК), состоящий из трех фаз - фазы I - покоя, фазы II - нерегулярной активности и фазы III - регулярной (ритмической) активности (рис. 25).

Период ММК составлял от 585 до 625 сек. Продолжительность фазы III - около 210 сек. Процент времени активности - 40%.

Электрическая активность тонкой кишки крыс в динамике развития обтурационного холестаза

5.4.2. Влияние механической желтухи на электрическую активность тонкой кишки крыс в динамике развития обтурационного холестаза

У 8 обследованных крыс с вживленными электродами моделировали обтурационный холестаз путем разъединения кишечного и желчного катетеров и закупорки последнего. Записи электрической активности проводились у всех крыс в первые, вторые, третьи сутки экспериментального холестаза (рис. 7). Длительность записей составляла - 1 час.

Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности показала, что в первые сутки развития обтурационного холестаза интенсивность генерации потенциалов действия была несколько снижена и составляла 3,01±0,56 у.е. (табл. 5). У всех крыс регистрировался регулярный ММК.

Период ММК достоверно превышал фоновые значения и составлял 750+70 сек. Продолжительность фазы III – 225+20 сек. Процент времени активности был повышен (63%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия прогрессивно снижалась, однако достоверно не отличалась от фона. Период ММК достоверно превышал фоновые значения, длительность периодов покоя возрастала и процент времени активности был снижен (35%). Продолжительность фазы III не отличалась от нормальных значений. На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия в тонкой кишки была достоверно ниже исходных значений и составляла 0,84+0,09 у.е. Период ММК достоверно превышал значения фона. Длительность периодов покоя возрастала за счет снижения нерегулярной активности. Продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в динамике развития обтурационного холестаза происходило прогрессивное снижение интенсивности генерации потенциалов действия гладкой мускулатуры кишечной стенки, и, следовательно, угнетение сократительной способности кишки. К третьим суткам регистрировался правильный мигрирующий миоэлектрический комплекс (ММК), однако, его период был увеличен, т. е. ритмические фазы возникали реже. При этом продолжитель ность ритмических фаз не изменялась и соответствовала нормальным значениям.

У 8 обследованных крыс с вживленными электродами моделировали обтурационный холестаз путем разъединения кишечного и желчного катетеров и закупорки последнего. Записи электрической активности проводились у всех крыс в первые, вторые, третьи сутки экспериментального холестаза (рис. 25). Длительность записей составляла - 1 час.

Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности показала, что в первые сутки развития обтурационного холестаза интенсивность генерации потенциалов действия была несколько снижена и составляла 3,01±0,56 у.е. (табл. 21). У всех крыс регистрировался регулярный ММК.

Период ММК достоверно превышал фоновые значения и составлял 750+70 сек. Продолжительность фазы III – 225+20 сек. Процент времени активности был повышен (63%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия прогрессивно снижалась, однако достоверно не отличалась от фона. Период ММК достоверно превышал фоновые значения, длительность периодов покоя возрастала и процент времени активности был снижен (35%). Продолжительность фазы III не отличалась от нормальных значений. На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия в тонкой кишки была достоверно ниже исходных значений и составляла 0,84+0,09 у.е. Период ММК достоверно превышал значения фона. Длительность периодов покоя возрастала за счет снижения нерегулярной активности. Продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в динамике развития обтурационного холестаза происходило прогрессивное  снижение интенсивности генерации потенциалов действия гладкой мускулатуры кишечной стенки, и, следовательно, угнетение сократительной способности кишки. К третьим суткам регистрировался правильный мигрирующий миоэлектрический комплекс (ММК), однако, его период был увеличен, т. е. ритмические фазы возникали реже. При этом продолжительность ритмических фаз не изменялась и соответствовала нормальным значениям.

Электрическая активность тонкой кишки крыс в период декомпрессии и зондового энтерального питания

По окончании третьих суток обтурационного холестаза всем крысам проводили декомпрессию (восстанавливали нормальный отток желчи в двенадцатиперстную кишку). В этих условиях все крысы были разделены на две группы – контрольная 4 - крысы, получающие энтеральное питание пищевой смесью “Нутризон” с аминокислотными добавками без глутамина, и опытная 4 - крысы, получающие энтеральное питание пищевой смесью “Нутризон” с добавлением 2% раствора глутамина. Записи электрической активности тонкой кишки проводили на первые, вторые и третьи сутки декомпрессии и энтерального питания (рис. 8 и 9). Длительность записей составляла - 1 час.

Электрическая активность тонкой кишки крыс в период декомпрессии и зондового энтерального питания

По окончании третьих суток обтурационного холестаза всем крысам проводили декомпрессию (восстанавливали нормальный отток желчи в двенадцатиперстную кишку). В этих условиях все крысы были разделены на две группы – контрольная 4 - крысы, получающие энтеральное питание пищевой смесью “Нутризон” с аминокислотными добавками без глутамина, и опытная 4 - крысы, получающие энтеральное питание пищевой смесью “Нутризон”  с добавлением 2 % раствора глутамина. Записи электрической активности тонкой кишки проводили на первые, вторые и третьи сутки декомпрессии и энтерального питания (рис. 26 и 27). Длительность записей составляла - 1 час.

Контрольная группа (энтеральное питание без глутамина)

Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности показала, что в первые сутки декомпрессии и энтерального питания с добавлением аминокислот не содержащего глутамин интенсивность генерации потенциалов действия была близка к фоновым значениям и составляла 2,87±0,44 у.е. (Табл. 6). У всех крыс регистрировался регулярный ММК. Период ММК достоверно превышал фоновые значения и составлял 770+82 сек. Продолжительность фазы III – 205+21 сек. Наблюдалось появление внеочередных III фаз. Процент времени активности был повышен (60%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия снижалась и достоверно отличалась от фона, составляя 1,14+0,19 у.е. Период ММК был слабо выражен, преобладала нерегулярная активность, и процент времени активности был высоким (64%). На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия возрастала, однако была достоверно ниже исходных значений и составляла 2,03+0,26 у.е.

Период ММК достоверно превышал значения фона за счет сильно выраженной нерегулярной активности. Продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

5.4.3. Контрольная группа (энтеральное питание без глутамина)

Компьютерная обработка регистрируемых сигналов электрической активности показала, что в первые сутки декомпрессии и энтерального питания с добавлением аминокислот не содержащего глутамин интенсивность генерации потенциалов действия была близка к фоновым значениям и составляла 2,87±0,44 у.е. (Табл. 22). У всех крыс регистрировался регулярный ММК. Период ММК достоверно превышал фоновые значения и составлял 770+82 сек. Продолжительность фазы III – 205+21 сек. Наблюдалось появление внеочередных III фаз. Процент времени активности был повышен (60%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия снижалась и достоверно отличалась от фона, составляя 1,14+0,19 у.е. Период ММК был слабо выражен, преобладала нерегулярная активность, и процент времени активности был высоким (64%). На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия возрастала, однако была достоверно ниже исходных значений и составляла 2,03+0,26 у.е.

Период ММК достоверно превышал значения фона за счет сильно выраженной нерегулярной активности. Продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

Опытная группа (энтеральное питание с добавлением глутамина)

Впервые сутки декомпрессии и энтерального питания с добавлением глутамина интенсивность генерации потенциалов действия не отличалась от фоновых значений и составляла 2,98±0,27 у.е. (табл. 7). Период ММК и продолжительность фазы соответствовали норме. Процент времени активности был повышен (55%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия возрастала, однако ее  значения достоверно не отличались от фона, и составляли 3,71+0,56 у.е. Период ММК был слабо выражен, преобладала сильная нерегулярная активность, и наблюдались внеочередные III фазы. Продолжительность фазы III, тем не менее, не отличалась от фоновых значений. Процент времени активности был высоким (78%). На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия не отличалась от исходных значений и составляла 3,12+0,41 у.е. Период ММК и продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

Сразу после декомпрессии (в первые сутки) наблюдалось резкое усиление интенсивности спайковой активности у животных контрольной и опытной групп. Это закономерный процесс, так как желчь является физиологическим стимулятором моторной функции тонкой кишки. Однако, уже на вторые сутки после декомпрессии наблюдались существенные различия в ответной реакции тонкой кишки на воздействия. В опытной группе животных (с добавлением глутамина) происходило дальнейшее усиление спайковой электрической активности, в то время как в контрольной группе она снизилась. К третьим суткам в опытной группе животных электрическая спайковая активность нормализовалась. В контрольной группе животных декомпрессия (с добавлением аминокислот без глутамина) интенсивность спайковой электрической активности была достоверно ниже исходных значений к третьим суткам декомпрессии. Кроме того, период ММК в контрольной группе превышал исходные значения даже к третьим суткам, в то время как в опытной группе период ММК нормализовался к концу опыта (третьи сутки).

На рис. 10 представлены примеры обработки электромиограмм методом спектрального анализа. Оценка изменения частоты медленных волн (или базального электрического ритма - БЭР) тощей кишки позволила выявить определенные тенденции изменения электрической активности в динамике развития и разрешения обтурационного холестаза. Как видно из представленных графиков, в первые сутки экспериментального холестаза происходит резкое скачкообразное увеличение частоты БЭР. К третьим суткам холестаза частота остается повышенной и при этом снижается амплитуда спектров. Восстановление оттока желчи в двенадцатиперстную кишку приводит к постепенной нормализации (к третьим суткам) как частоты, так и амплитуды БЭР.

Опытная группа (энтеральное питание с добавлением глутамина)

Впервые сутки декомпрессии и энтерального питания с добавлением глутамина интенсивность генерации потенциалов действия не отличалась от фоновых значений и составляла 2,98±0,27 у.е. (табл. 23). Период ММК и продолжительность фазы соответствовали норме. Процент времени активности был повышен (55%) за счет увеличения нерегулярной активности. Во вторые сутки интенсивность генерации потенциалов действия возрастала, однако ее  значения достоверно не отличались от фона, и составляли 3,71+0,56 у.е. Период ММК был слабо выражен, преобладала сильная нерегулярная активность, и наблюдались внеочередные III фазы. Продолжительность фазы III, тем не менее, не отличалась от фоновых значений. Процент времени активности был высоким (78%). На третьи сутки интенсивность генерации потенциалов действия не отличалась от исходных значений и составляла 3,12+0,41 у.е. Период ММК и продолжительность фазы III не отличалась от нормы.

Сразу после декомпрессии (в первые сутки) наблюдалось резкое усиление интенсивности спайковой активности у животных контрольной и опытной групп. Это закономерный процесс, так как желчь является физиологическим стимулятором моторной функции тонкой кишки. Однако, уже на вторые сутки после декомпрессии наблюдались существенные различия в ответной реакции тонкой кишки на воздействия. В опытной группе животных (с добавлением глутамина) происходило дальнейшее усиление спайковой электрической активности, в то время как в контрольной группе она снизилась. К третьим суткам в опытной группе животных электрическая спайковая активность нормализовалась. В контрольной группе животных декомпрессия (с добавлением аминокислот без глутамина) интенсивность спайковой электрической активности была достоверно ниже исходных значений к третьим суткам декомпрессии. Кроме того, период ММК в контрольной группе превышал исходные значения даже к третьим суткам, в то время как в опытной группе период ММК нормализовался к концу опыта (третьи сутки).

На рис. 28 представлены примеры обработки электромиограмм методом спектрального анализа. Оценка изменения частоты медленных волн (или базального электрического ритма - БЭР) тощей кишки позволила выявить определенные тенденции изменения электрической активности в динамике развития и разрешения обтурационного холестаза. Как видно из представленных графиков, в первые сутки экспериментального холестаза происходит резкое скачкообразное увеличение частоты БЭР. К третьим суткам холестаза частота остается повышенной и при этом снижается амплитуда спектров. Восстановление оттока желчи в двенадцатиперстную кишку приводит к постепенной нормализации (к третьим суткам) как частоты, так и амплитуды БЭР.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при экспериментальном холестазе происходят серьезные нарушения моторной функции тонкой кишки, проявляющиеся как в снижении ее сократительной способности, так и нарушении ее координированной деятельности.

Нарушения энтерогепатического круговорота желчи представляет собой важное патогенетическое звено при развитии ряда заболеваний. Затрудненный отток желчи из печени в кишку вследствие механического препятствия приводит к хронической нехватке желчи в кишечнике, недостаточности переваривания и всасывания нутриентов.

Функцию желчи как внутриполостного стимулятора сокращений кишечника следует признать весьма важной в самовозобновлении ритма периодической деятельности. И поскольку наиболее четкие циклы и способность стимулировать моторику присущи желчным кислотам, можно предположить, что энтеропатическая циркуляция желчных кислот играет существенную роль в образовании ММК.

Восстановление оттока желчи в двенадцатиперстную кишку оказывает нормализующее влияние на интенсивность спайковой электрической активности тонкой кишки. Добавление глутамина к питательной смеси “Нутризон” приводит к более быстрому восстановлению сократительной активности тонкой кишки.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при экспериментальном холестазе происходят серьезные нарушения моторной функции тонкой кишки, проявляющиеся как в снижении ее сократительной способности, так и нарушении ее координированной деятельности.

Нарушения энтерогепатического круговорота желчи представляет собой важное патогенетическое звено при развитии ряда заболеваний. Затрудненный отток желчи из печени в кишку вследствие механического препятствия приводит к хронической нехватке желчи в кишечнике, недостаточности переваривания и всасывания нутриентов.

Функцию желчи как внутриполостного стимулятора сокращений кишечника следует признать весьма важной в самовозобновлении ритма периодической деятельности. И поскольку наиболее четкие циклы и способность стимулировать моторику присущи желчным кислотам, можно предположить, что энтеропатическая циркуляция желчных кислот играет существенную роль в образовании ММК.

Восстановление оттока желчи в двенадцатиперстную кишку оказывает нормализующее влияние на интенсивность спайковой электрической активности тонкой кишки. Добавление глутамина к питательной смеси “Нутризон” приводит к более быстрому восстановлению сократительной активности тонкой кишки.

Научная новизна

Разработана модель обтурационного холестаза, которая в условиях хронического эксперимента на необездвиженных и ненаркотизированных крысах позволяет оценивать влияние различных лечебных мероприятий, в частности, эффективность декомпрессии в сочетании с энтеральным питанием в коррекции печеночно-кишечной недостаточности при обтурационном холестазе (механической желтухе).

Впервые в условиях хронического эксперимента удалось охарактеризовать динамику печеночно-кишечной недостаточности на модели обтурационного холестаза. Показано, что через 3-е суток обтурации желчного протока развивается печеночная недостаточность, проявляющаяся резким повышением концентрации билирубина и холевой кислоты в желчи, повышением содержания ферментов маркеров АСТ, АЛТ, gГТП в плазме крови параллельно с изменениями кишечных ферментов и угнетением электрической активности в тонкой кишке.

Показано, что энтеральное питание смесью, обогащенной глутамином, в сочетании с декомпрессией желчных протокой способствует более быстрому и более эффективному разрешению печеночно-кишечной недостаточности с ранней нормализацией лабораторных маркеров печеночной недостаточности и электрической активности кишечника по сравнению с контрольной группой животных, получавших энтеральное питание с добавкой аминокислот, не содержащих глутамин.

С целью коррекции печеночно-кишечной недостаточности, обусловленных обтурационным холестазом, глутамин целесообразно вводить с первых же часов после разрешения обтурации желчевыводящих путей.

Резюме

Разработана модель обтурационного холестаза, которая в условиях хронического эксперимента на необездвиженных и ненаркотизированных крысах позволяет оценивать влияние различных лечебных мероприятий, в частности, эффективность декомпрессии в сочетании с энтеральным питанием в коррекции печеночно-кишечной недостаточности при обтурационном холестазе (механической желтухе).

Впервые в условиях хронического эксперимента удалось охарактеризовать динамику печеночно-кишечной недостаточности на модели обтурационного холестаза. Показано, что через 3-е суток обтурации желчного протока развивается печеночная недостаточность, проявляющаяся резким повышением концентрации билирубина и холевой кислоты в желчи, повышением содержания ферментов маркеров АСТ, АЛТ, gГТП в плазме крови параллельно с изменениями кишечных ферментов и угнетением электрической активности в тонкой кишке.

Показано, что энтеральное питание смесью, обогащенной глутамином, в сочетании с декомпрессией желчных протокой способствует более быстрому и более эффективному разрешению печеночно-кишечной недостаточности с ранней нормализацией лабораторных маркеров печеночной недостаточности и электрической активности кишечника по сравнению с контрольной группой животных, получавших энтеральное питание с добавкой аминокислот, не содержащих глутамин.

С целью коррекции печеночно-кишечной недостаточности, обусловленных обтурационным холестазом, глутамин целесообразно вводить с первых же часов после разрешения обтурации желчевыводящих путей.

9. Эффективность

Экспериментальные исследования показали, что энтеральное введение глутамина наряду с декомпрессией желчных путей является эффективным средством для устранения печеночно-кишечной недостаточности, обусловленной обтурацией желчных протоков.

Полученные в эксперименте данные позволяют рекомендовать клиническое применение глутамина у пациентов с обтурационным холестазом. Назначение глутамина при этапном лечении холестаза, с целью устранения печеночно-кишечной недостаточности и коррекции метаболизма наряду с использованием чрезкожной чрезпеченочной микрохолецистостомии позволит позитивно изменить структуру выполняемых холецистоэктомий в пользу отсроченных и плановых операций, что, в свою очередь, позволит снизить число послеоперационных осложнений и показателей летальности.

Экспериментальные исследования показали, что энтеральное введение глутамина наряду с декомпрессией желчных путей является эффективным средством для устранения печеночно-кишечной недостаточности, обусловленной обтурацией желчных протоков.

Полученные в эксперименте данные позволяют рекомендовать клиническое применение глутамина у пациентов с обтурационным холестазом. Назначение глутамина при этапном лечении холестаза, с целью устранения печеночно-кишечной недостаточности и коррекции метаболизма наряду с использованием чрезкожной чрезпеченочной микрохолецистостомии позволит позитивно изменить структуру выполняемых холецистоэктомий в пользу отсроченных и плановых операций, что, в свою очередь, позволит снизить число послеоперационных осложнений и показателей летальности.

10. Выводы

1. Моделируемый в хронических экспериментах на крысах 3-х суточный обтурационный холестаз сопровождается повышением содержания билирубина и холевой кислоты в желчи, повышением содержания ферментных маркеров печеночной недостаточности (АСТ, АЛТ, g-ГТП) вплазме крови,… и динамически нарастающем угнетением электрической активности в тонкой кишке.

2. Энтеральное введение глутамина в составе питательной смеси на фоне декомпрессии желчных протоков и восстановлении поступления желчи в кишечник позволяет устранить проявления печеночной недостаточности и добиться быстрого и полноценного восстановления электрической активности тонкого кишечника.

3. Энтеральное введение глутамина в сочетании с декомпрессией и восстановлением поступления желчи в кишечник оказывает стимулирующее влияние на активность адсорбированных и кишечных ферментов во всех отделах тонкой кишки.

Моделируемый в хронических экспериментах на крысах 3-х суточный обтурационный холестаз сопровождается повышением содержания билирубина и холевой кислоты в желчи, повышением содержания ферментных маркеров печеночной недостаточности (АСТ, АЛТ, g-ГТП) в плазме крови,… и динамически нарастающем угнетением электрической активности в тонкой кишке.

Энтеральное введение глутамина в составе питательной смеси на фоне декомпрессии желчных протоков и восстановлении поступления желчи в кишечник позволяет устранить проявления печеночной недостаточности и добиться быстрого и полноценного восстановления электрической активности тонкого кишечника.

Энтеральное введение глутамина в сочетании с декомпрессией и восстановлением поступления желчи в кишечник оказывает стимулирующее влияние на активность адсорбированных и кишечных ферментов во всех отделах тонкой кишки.