28 февраля 1868 года на основе Шинсенгуми правительство сёгуната образовало новую армию Синбутай, но более половины воинов Новой Гвардии сразу же покинули её. 6 марта 1868 года силы бакуфу приняли участие в сражении с армией правительства Мэйдзи в Кацунуме, но, потерпев сокрушительное поражение, Синбутай распался.

Воины Шинсенгуми вновь были вынуждены отступить. Неопределённость ситуации породила несогласие Саноске Харады и Синпачи Нагакуры с решениями командиров, поэтому они предпочли образовать свой собственный отряд, Сейхитай, и отправиться в Айзу. Но вскоре Саноске Харада покинул Сейхитай и пришёл в Эдо, чтобы присоединиться к армии Шогитай.

1 апреля 1868 года штаб-квартира Шинсенгуми была перенесена из Эдо в Нагареяму, и спустя два дня её окружила объединённая армия Сатсумы и Тёсю. Чтобы вырваться из окружения, Исами Кондо вышел навстречу войскам, представившись вымышленным именем. Тем не менее, среди воинов нашлись люди, которые смогли опознать предводителя Шинсенгуми. Патриоты из провинции Тоса, обвинявшие Новую Гвардию в смерти Рёма Сакамото, сумели добиться для её командира самого сурового наказания и 25 апреля 1868 года Исами Кондо был обезглавлен в Итабаси. Ему было 35 лет.

Тем временем, туберкулёз забирал последние силы Окиты Содзи. Он находился в одном из госпиталей Эдо, и окружавшие Окиту люди были поражены добротой и стойкостью его характера. Несмотря на приближающуюся смерть, юноша всегда находится в бодром расположении духа и рассказывал смешные истории из своей жизни. Когда же известие о казни Исами Кондо достигло Эдо, никто не решился рассказать об этом Оките, несмотря на его постоянные вопросы о судьбе своего учителя. Окита Содзи скончался от туберкулёза 30 мая 1868 года в возрасте 25 лет.

4 апреля 1868 года Тошизо Хидзиката вместе с Кейске Отори образовал последнюю армию бакуфу, которая вступила в битву с силами нового правительства в Уцономийе. Вновь потерпев поражение, люди Хидзикаты были вынуждены отступить в Айзу. 5 апреля Хидзиката объединился с Такамори Мацудайрой. Спустя сутки Шинсенгуми была направлена в Сиракаву, чтобы поддержать один из отрядов бакуфу. Однако ранения Хидзикаты не позволили ему участвовать в этом рейде, поэтому командование Шинсенгуми принял Хаджиме Сайто (под вымышленным именем Дзюро Ямагучи), который успешно использовал тактику партизанской войны против превосходящих сил армии Императора. 21 августа Новая Гвардия проиграла сражение при Бонари и отступила в один из замков Айзу. 4 сентября 1868 года четвёртый отряд Шинсенгуми под предводительством Хаджиме Сайто принял участие в жестоком сражении, в котором погибли почти все двадцать воинов.

20 октября 1868 года Тошизо Хидзиката вместе с немногочисленными остатками Шинсенгуми прибыл на острова Хоккайдо, где была образована новая штаб-квартира Новой Гвардии. 15 декабря Хидзиката был назначен министром обороны новообразованной республики Эзо, во главе которой встал адмирал Такеаки Эномото. В 1869 году армия правительства Мэйдзи атаковала Хоккайдо, чтобы положить конец всем вызовам новой власти. Тошизо Хидзиката возглавил оборону острова. Ему удалось добиться нескольких побед, однако 1 мая Шинсенгуми была вынуждена отступить в Хокадате. Тошизо Хидзиката погиб 11 мая 1869 года во время последней битвы войны Бошин. Ему было 35 лет. Эта смерть стала последней точкой в истории Новой Гвардии.

Из командиров Шинсенгуми только двоим удалось выжить и наблюдать за тем, как Япония начинает жить в новой эпохе Мэйдзи. Этими людьми были Синпачи Нагакура и Хаджиме Сайто.