Несмотря на все усилия, прилагаемые Кондо и Хидзикатой, уже ничто не могло остановить медленный распад Новой Гвардии, и немаловажную роль в этом сыграла политика. 2 января 1866 года при посредничестве Рёма Сакамото прошли переговоры между Когоро Кацурой и Такамори Сайго, после чего был заключён союз провинций Сатсума и Тёсю. Прошло почти два года, и 14 октября 1867 года последний сёгун Йошинобу Токугава был вынужден передать всю полноту государственной власти Императору Японии.

15 ноября 1867 года Рёма Сакамото был убит. По Киото поползли слухи о том, что в убийстве виновны Волки Мибу - якобы на месте преступления видели ножны Саноске Харады и принадлежащую ему обувь. В результате, Шинсенгуми возненавидели в Тосе, родной провинции Сакамото. Лишь два года спустя выяснилось, что Рёма Сакамото убили люди из отряда обороны Киото под предводительством Тадасабуро Сасаки. Тем не менее, патриоты были уверены в причастности к убийству некоего Ясутаро Миуры, который хитростью мог заставить Шинсенгуми убить Сакамото. 7 декабря 1867 года воины из Тосы организовали покушение на Миуру, но Тошизо Хидзиката, Хаджиме Сайто, Саноске Харада, Каничиро Йошимура, Ёситаро Кишима и Казе Сома сумели отбить нападение.

Около 5 часов вечера 3 января 1868 года пушечный залп возвестил о начале последней и самой грандиозной битвы времён Бакумацу. В первом сражении войны Бошин Новая Гвардия понесла огромные потери - было убито более тридцати человек, среди которых оказались капитан шестого отряда Гинзабуро Иное и командир разведки Сусуму Ямазаки. Шинсенгуми пришлось отступить в замок Осака, но Каничиро Йошимура (один из друзей Ямазаки) не пожелал покидать поле боя и совершил сэпукку. После битвы при Тобафушими Новая Гвардия перегруппировалась в Эдо. В подразделении осталось всего лишь 44 человека, поэтому Кондо и Хидзиката приняли решение выстроить третью иерархию, исходя из ограниченного количества людей:

Командир (Taichou):

Исами Кондо (Kondou Isami Masanobu (Masayoshi)).

Заместитель командира (Fukuchou):

Тошизо Хидзиката (Hijikata Toshizou Yoshitoyo).

Капитаны и помощники заместителя командира (Fukuchou Jokin):

Окита Содзи/Соуши (Okita Souji (Soushi) Kaneyoshi (Fusanaga));

Синпачи Нагакура (Nagakura Shinpachi Noriyuki);

Сунтаро Огата (Ogata Shuntarou);

Саноске Харада (Harada Sanosuke);

Хаджиме Сайто (Saitou Hajime).

Внутренние расследования (Roushi Chouyaku):

Кувадзиро Оойси (Ooishi Kuwajirou);

Хаято Кавамура (Kawamura Hayato).

Ответственные офицеры/капралы (Gochou):

Кай Шимада (Shimada Kai);

Нобутаро Хаяси (Hayashi Nobutarou);

Козо Кахара (Kahara Kouzou);

Гиске Кондо (Kondou Gisuke);

Такезо Шимура (Shimura Takezou);

Масачика Кумебе (Kumebe Masachika);

Сейчиро Озеки (Ozeki Seiichirou);

Горо Маено (Maeno Gorou);

Косабуро Накамура (Nakamura Kosaburou).

Бухгалтеры (Kaikeigata):

Ютаро Кисидзима (Yutarou Kishijima);

Кенноске Яучи (Yauchi Kennosuke);

Исао Оотани (Ootani Isao);

Сайске Ясутоми (Yasutomi Saisuke);

Казуджизо Канзаки (Kanzaki Kazujizou).