Несмотря на внешнее благополучие, внутри Новой Гвардии продолжалось ужесточение дисциплины, что часто приводило к появлению отступников - людей, нарушивших внутренний Кодекс подразделения.

За несколько месяцев до формирования новой иерархии в Шинсенгуми прогремело дело Кейске Яманами. Один из людей, с которым Исами Кондо и Тошизо Хидзиката прошли долгий путь от Росингуми до Новой Гвардии, со временем начал тяготеть к реформистам из движения "Сонно Дзёй". Это вынудило Кондо и Хидзикату ограничить круг общения Яманами, но вскоре их друг сбежал из своего отряда, что автоматически превратило его в предателя. Беглеца выследил Окита Содзи. Как и его учитель, Окита долгое время знал Кейске Яманами, поэтому ему был дан шанс сбежать снова, однако Кейске отказался и добровольно вернулся в штаб-квартиру Новой Гвардии, где и совершил самоубийство в наказание за нарушение второй статьи Кодекса. Внутренний устав не предусматривал более мягкого наказания для отступников, но смерть Яманами вызвала недовольство среди воинов Шинсенгуми. Кейске Яманами по праву считался очень честным и уважаемым человеком и многие были уверены, что Тошизо Хидзиката, отвечавший за поддержание внутренней дисциплины, поступил невероятно жестоко по отношению к своему другу. Но помимо Яманами в Новой Гвардии были и другие воины, чью жизнь решил Кодекс Шинсенгуми:

Кейноске Миура (Miura Keinosuke) - сын Сюзана Сакумы (одного из великих мыслителей времён Бакумацу). Высокомерный и заносчивый человек, неподобающее поведение которого бросало тень на всю Шинсенгуми;

Тададзи Мацубара (Matsubara Tadaji) - капитан 4 отряда Шинсенгуми. Был вынужден совершить самоубийство из-за любовной истории;

Киcабуро Каваи (Kawai Kisaburou) - ответственный за операции зачистки. Был вынужден совершить самоубийство из-за большого количества неоплаченных долгов;

Братья Тани (Мантаро, Санджуро и Кондо Сюэй) - были главными возмутителями спокойствия в подразделении. Санджуро Тани, капитан 7 отряда Шинсенгуми, позднее был убит Хаджиме Сайто.

Со временем штаб-квартира Шинсенгуми была перенесена в храм Ниси Хонган, за что Волков Мибу возненавидели местные монахи (и в особенности Канефуми Нишимура - первый человек, обобщивший и записавший историю Новой Гвардии.) Спустя несколько месяцев штаб-квартира вновь поменяла своё месторасположение, переехав в здание, специально выстроенное монахами. После этого побег совершил Канрюссай Такеда, капитан 5 отряда Шинсенгуми. Он присоединился к армии провинции Сатсума, но позднее был выслежен и убит Хаджиме Сайто.

Самый массовый случай дезертирства произошёл 10 марта 1867 года, когда Шинсенгуми покинуло сразу 15 человек, которых возглавил военный советник Каситаро Ито. Среди отступников оказались: Хаттори Такео, Дзюро Абе, Яби Томийяма, Нобори Наканиши, Микисабуро Сузуки, Тадао Арай, Васио Кано, Кайске Хасимото, Дзиро Наками, Тайносин Синохара, Хейске Тодо, Киёси Киёхара, Юноске Монай и Хаджиме Сайто. Тем не менее, вторая статья Кодекса оставалась неизменной - людей, покинувших отряд, ожидала смерть. Никто не знал о том, что среди предателей у Кондо и Хидзикаты был осведомитель. Им оказался капитан 3 отряда Шинсенгуми Хаджиме Сайто, который посылал точные сведения о передвижении Каситаро Ито и его людей, одновременно изображая из себя пьяницу и балагура (чтобы не выходить из образа, Сайто даже несколько раз совершал грабежи и посещал публичные дома). 18 ноября 1867 года отряд Ито был вовлечён в происшествие, известное как "Резня в Абуронокойе". И хотя многим отступникам удалось выжить, их предводители - Каситаро Ито, Хаттори Такео и Хейске Тодо - были убиты в бою. Этот инцидент не был забыт, и 18 декабря несколько человек из группы Ито предприняли попытку отомстить своим бывшим командирам - Окита Содзи чудом избежал смерти, а Исами Кондо был ранен в плечо в результате покушения. Хаджиме Сайто навсегда остался самым ненавистным человеком для тех, кто пережил схватку в Абуронокойе, так как именно его считали виновным в гибели Каситаро Ито.