Потери Шинсенгуми в битве с армией Тёсю оказались незначительными, и всё же Исами Кондо отправился в Эдо для набора новых рекрутов. Вскоре после его возвращения произошла очередная реорганизация Новой Гвардии, и в 1865 году появилась вторая и самая известная иерархия Шинсенгуми:

Командир (Souchou):

Исами Кондо (Kondou Isami Masanobu (Masayoshi)).

Заместитель командира (Fukuchou):

Тошизо Хидзиката (Hijikata Toshizou Yoshitoyo).

Военный советник (Sanbou):

Каситаро Ито (Itou Kashitarou Takeaki).

Капитаны (Kumichou):

1 отряд: Окита Содзи/Соуши (Okita Souji (Soushi) Kaneyoshi (Fusanaga));

2 отряд: Синпачи Нагакура (Nagakura Shinpachi Noriyuki);

3 отряд: Хаджиме Сайто (Saitou Hajime);

4 отряд: Цудзи Мацубара (Matsubara Chuuji (Tadaji));

5 отряд: Канрюссай Такеда (Takeda Kanryuussai);

6 отряд: Гинзабуро Иное (Inoue Genzaburou Kazushige);

7 отряд: Санджуро Тани (Tani Sanjuurou);

8 отряд: Хейске Тодо (Toudou Heisuke Nobutora);

9 отряд: Микисабуро Сузуки (Suzuki Mikisaburou);

10 отряд: Саноске Харада (Harada Sanosuke).

Ответственные офицеры/капралы (Gochou):

Кай Шимада (Shimada Kai);

Содзи Кавасима (Kawashima Shouji (Katsuji));

Нобутаро Хайяши (Hayashi Nobutarou);

Эйске Окузава (Okuzawa Eisuke)

Горо Маено (Maeno Gorou);

Дзюро Абе (Abe Juurou);

Такехачиро Каяма (Kayama Takehachirou);

Тецугоро Ито (Itou Tetsugorou);

Ёситаку Кондо (Kondou Yoshitaku);

Масачика Кумебе (Kumebe Masachika);

Васио Кано (Kanou Washio);

Нобори Наканиши (Nakanishi Nobori);

Козо Охара (Ohara Kouzou);

Яби Томияма (Tomiyama Yabee);

Косабуро Накамура (Nakamura Kosaburou);

Котаро Икеда (Ikeda Kotarou);

Кайске Хасимото (Hashimoto Kaisuke);

Цукаса Ибараги (Ibaragi Tsukasa).

Наблюдение за внутренней дисциплиной и разведка (Roushi Torishimari Yaku Narabi Kansatsu Gata):

Сусуму Ямазаки (Yamazaki Susumu);

Сунтаро Огата (Ogata Shuntarou);

Тайносин Синохара (Shinohara Tainoshin);

Тадао Арай (Arai Tadao);

Нобори Асийя (Ashiya Nobori);

Каничиро Йошимура (Yoshimura Kan-Ichirou).

Ответственный за операции зачистки (Kanjou Gakari):

Киcабуро Каваи (Kawai Kisaburou);

Учителя кендзюцу (Kenjutsu Shihan Gashira):

Окита Содзи/Соуши (Okita Souji (Soushi) Kaneyoshi (Fusanaga));

Хаджиме Сайто (Saitou Hajime);

Синпачи Нагакура (Nagakura Shinpachi Noriyuki);

Котаро Икеда (Ikeda Kotarou);

Тадао Арай (Arai Tadao);

Каничиро Йошимура (Yoshimura Kan-Ichirou);

Торазо Танака (Tanaka Torazou);

Такео Хаттори (Hattori Takeo).

Учителя рукопашного боя (Juujitsu Shihan Gashira):

Тайносин Синохара (Shinohara Tainoshin);

Тададзи Мацубара (Matsubara Tadaji);

Сатаро Шинода (Shinoda Satarou).

Учителя литературы и культуры (Bungaku Shihan Gashira):

Каситаро Ито (Itou Kashitarou Takeaki).

Сунтаро Огата (Ogata Shuntarou);

Канрюссай Такеда (Takeda Kanryuussai);

Юноске Монай (Yuunosuke Mounai);

Юзо Танба (Yuuzou Tanba).

Учителя артиллерийского дела (Houjutsu Shihan Gashira):

Дзюро Абе (Abe Juurou);

Киёси Киёхара (Kiyohata Kiyoshi).

Учитель конной подготовки (Bajutsu Shihan Gashira):

Сайске Ясутоми (Saisuke Yasutomi).

Учитель боя с копьём (Soujutsu Shihan Gashira):

Санджуро Тани (Tani Sanjuurou).

Основу новой иерархии Шинсенгуми составляли десять отрядов, капитаны которых подчинялись непосредственно командиру и его заместителю. Каждый отряд состоял из десяти человек, двое из которых были ответственными офицерами, подчинёнными капитану.