После инцидента с Сюбеем Ямато Такамори Мацудайра был вынужден отдать приказ об устранении Камо Серизавы. Кондо и его заместитель Тошизо Хидзиката чётко осознавали, что убийство Серизавы сопряжено со множеством трудностей, так как он был одним из трёх командиров Шинсенгуми, которого поддерживали лучшие воины подразделения - Нишики Ниими и Горо Хирайяма. После недолгих раздумий Кондо и Хидзиката решили сперва избавиться от помощников Серизавы, и их первой целью стал Нишики Ниими. В начале сентября 1863 года он был вынужден совершить сэпукку за нарушение первой и третьей статей Кодекса Шинсенгуми (Ниими часто обвиняли в вымогательствах и грабежах торговцев, а также в поведении, недостойном воина).

Следующей своей целью Кондо и Хидзиката избрали Камо Серизаву. 16 сентября 1863 года состоялось плановое собрание Шинсенгуми. Обычно после него происходило бурное празднование с участием Серизавы и его людей, и этот день не стал исключением. К ночи опьянённый командир уже не мог самостоятельно держаться на ногах. С помощью Горо Хирайямы и Дзуске Хирамы он добрался до штаб-квартиры в Мибу, где вместе с друзьями уединился в доме со своими женщинами. Именно это время Исами Кондо использовал для своего нападения. Первым в покои спящего командира ворвался Окита Содзи, атаковавший Серизаву без предупреждения. Отрезвлённый пониманием того, что его хотят убить, Серизава выхватил короткий меч и отразил атаку Содзи, легко ранив его. Но вслед за Окитой появился Тошизо Хидзиката. Будучи не в состоянии сражаться в полную силу из-за полученных ран, Камо Серизава не смог противостоять его напору и вскоре был убит. Его первый помощник, Горо Хирайяма, был убит Кейске Яманами и Саноске Харадой в ту же ночь. Сбежать с места расправы удалось лишь Дзуске Хираме.

Существует ряд противоречий о том, кто же на самом деле убил Камо Серизаву. Сын владельца дома, где произошла расправа, утверждал, что в ту ночь видел Окиту, Хараду и Яманами. Синпачи Нагакура писал в своих воспоминаниях, что в акции принимали участие Окита, Хидзиката, Тодо, а также Исетаке Микура (участие этого человека сомнительно, так как позже он был раскрыт как шпион патриотов из Тёсю). Сам Нагакура признался, что ничего не знал о готовящемся убийстве, и скорее всего Серизава был убит Окитой, Хидзикатой, Иное и Харадой. Если присовокупить ко всему вышесказанному письма уцелевшего Дзуске Хирамы, то можно сделать вывод, что Камо Серизаву убили Окита Содзи, Тошизо Хидзиката и ещё двое человек (либо Хейске Тодо, либо Гинзабуро Иное, либо Кейске Яманами, либо Саноске Харада).

На следующий день после убийства Исами Кондо разослал письма с трагической новостью о том, что Камо Серизава пал жертвой ночного нападения бандитов. 20 сентября 1863 года состоялась пышная траурная церемония, на которой собралось множество высокопоставленных чиновников провинции Айзу, а также два человека, которых называли старшими братьями убитого командира. В статусе нового командира Исами Кондо произнёс торжественную речь и всё время, пока шли похороны Серизавы и Хирайямы в храме Мибу, воины Новой Гвардии не выпускали оружие из своих рук.

16 сентября 1863 года принято считать датой возникновения настоящей Шинсенгуми. После смерти Серизавы всё командование перешло в руки Исами Кондо и его помощников - людей, безоговорочно преданных идеям, ради которых и создавалась Шинсенгуми. Именно они превратили Новую Гвардию в самое дисциплинированное и боеспособное воинское подразделение на службе сёгуната.