ОТЧЕТ
о проделанной работе по авторской
разработке на тему «Исследование
иммуномодулирующих свойств ДЗУ»
Руководитель разработки
Директор республиканского
межведомственного научно-
исследовательского центра
клинической иммунологии
КНИИ урологии и нефрологии
д.м.н Г.Н.Драник
Ответственные исполнители
Старший научный сотрудник
к.б.н. Л.Я.Кушко
младший научный сотрудник И.И.Озвинчук
младший научный сотрудник К.К.Листопад
инженер Е.Л.Прохневская
г.Киев 24 декабря 1991 г.
В настоящее время, в силу сложившейся экологической обстановки, существует угроза дальнейшего роста заболеваемости и смертности среди взрослого и детского населения. Это подтверждается систематическим анализом заболеваемости и смертности, проведенным в различных регионах республики, особенно на контролируемых территориях. Расчеты указывают на то, что продолжительность жизни населения, подвергшегося воздействию Чернобыльской катастрофы, уже сокращена на 8 лет по сравнению с теми, на кого в этих районах катастрофа воздействия не оказала. При этом главный удар приняла на себя иммунная система. В иммунитете лиц, принявших участие в ликвидации аварии на ЧАЭС и проживающих длительное время в условиях пролонгированного воздействия малых доз радиации, регистрируются разнообразные по степени и точках приложения нарушения. Нами было обследовано более тысячи практически здоровых лиц, проживающих и работающих в г.Киеве, не выезжавших из города во время чернобыльской катастрофы. В результате был выявлен и описан «синдром быстрой утомляемости», связанный с различными вариантами иммунного дефицита и, преимущественно, с подавлением активности естественных киллеров.
Значительно возрос удельный вес аллергических заболеваний, особенно у детей, родившихся в 1096-1989 гг., чьи родители и они сами не выезжали за пределы контролируемых территорий все это время. Увеличился уровень аутоиммунной патологии и других проявлений иммунодефицитов.
Все это диктует необходимость применения средств, методов лечения, направленных на коррекцию иммунной системы, как у детей, так и у взрослых.
Однако применение традиционных методов лечения зачастую малоэффективно, создается лишь временный эффект коррекции иммунитета. Поэтому в настоящее время осуществляется поиск различных методов и средств, оказывающих не только необходимый иммуномодулирующий эффект, но и повышающий адаптивные свойства иммунной системы без каких-либо вредных для организма последствий.
Большой научный и практический интерес поэтому представляет изучение различных народных методов лечения, которые не получили ранее признания официальной медициной, но были достаточно эффектны и широко применялись народными целителями.
Еще в начале 80-х годов А.А.Беридзе-Стаховский применял для лечения различных заболеваний, в том числе онкологических, долговременное запоминающее устройство /ДЗУ/. ( Это устройство впоследствии получило названия Церпан и с этим названием сейчас известно исследователям – прим. Ред.) Положительный эффект влияния ДЗУ на течение различных болезней был несомненным. Поэтому в настоящее время исследование иммуномодулирующих свойств ДЗУ А.А.Беридзе-Стаховского представляется весьма важным не только в научном, но и в практическом аспекте.
Цель исследования – изучить влияние ДЗУ на иммунную систему в модельных экспериментах in vivo и in vitro. Для этого нами были выбраны тесты, дающие представление о функциональном состоянии клеток, относящихся к различным звеньям иммунной системы, в частности, фагоцитирующая и ферментивная активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда, активность естественных киллеров, пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены / реакция бласттрансформации лимфоцитов, РБТЛ/, определение уровня содержания интерферона в сыворотке крови и способности иммунокомпетентных клеток продуцировать различные его виды.
Материалы и методы
Эксперименты были выполнены на мышах линии СВА С57ВI. Их подвергали воздействию ДЗУ в течение 10 мин. Сосуд с животным находился от прибора на расстоянии 10-11 см. Через 1-1.5 часа или через сутки животных забивали декапитацией, в асептических условиях собирали кровь для получения сыворотки, выделяли лимфатические узлы и клетки перитонеальной полости, В стерильных условиях с помощью гомогенизатора Поттера готовили взвесь клеток из лимфатических узлов. Полученные клетки исследовали в вышеперечисленных тестах.
Оптимальное время воздействия было установлено в эксперименте, проведенном на культурах клеток. Достоверно стимулирующий эффект воздействия на процессы роста и размножения клеток проявился через 10 минут.
1.Фагоцитарная активность определялась по поглощению частичек латекса клетками перитонеальной полости. Для выделения перитонеальных макрофагов мышам вводят внутрибрюшинно охлажденную среду и после кратковременного пальпирования отбирают внутриперитонеальный экссудат. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1500 об/мин. К осадку добавляют 0.2 мл среды, рессуспендируют и наносят на предметные стекла. Через 20-30 мин. при 37 градусов С макрофаги прикрепляются к стеклу. Неприкрепившиеся клетки удаляют с помощью раствора Хенкса. Затем на стекло наносят взвесь частиц латекса и инкубируют во влажной атмосфере при 37 градусов С в течение 30 мин. После этого стекла отмывают теплым раствором Хенкса для удаления непоглощенных частиц. Стекла высушивают, фиксируют смесью Никифорова /15-20 мин./
и окрашивают по Романовскому-Гимза 5-15 мин. При микроскопическом исследовании подсчитывают не менее 200 макрофагов, отмечая количество фагоцитированных клеток и количество частиц латекса, поглощенных одним макрофагом.
Фагоцитарное число /ФЧ/ определяется по формуле :
количество поглощенных частичек
ФЧ = ---------------------------------------------------
Количество фагоцитирующих клеток
2.Ферментативную активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда определяли по восстановлению тетразолиевого нитросинего /НСТ/, который нормальными клетками восстанавливается до формазана. Принцип теста состоит в том, что при активации фагоцитирующих клеток происходит восстановление бесцветного тетразолия нитросинего в диформазан, который распределяется в цитоплазме и на поверхности фагоцитов в виде гранул, окрашенных в темно-синий цвет. Стекла с прикрепившимися макрофагами подготавливаются также, как и при изучении активности фагоцитоза /описанного выше. На стекло с клетками наносят 0.2% раствор нитрозолия синего и инкубируют во влажной камере при 37 градусов С в течение 30 минут. Затем стекла отмывают, высушивают, фиксируют смесью Никифорова. После окрашивания препаратов метиленовым зеленым подсчитывают количество фагоцитов, содержащих диформазан. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток, цитохимический показатель активности вычисляли по формуле
О * п + 1 * п + 2 * П + 3 * п
ЦПА = -----------------------------------------
Количество клеток
где:
п – количество клеток, поглотивших НСТ О - количество клеток, не поглотивших НСТ
1 - поглотившие 2-7 частичек
2 – клетка на 1/3 заполнена НСТ
3 – клетка на 2/3 заполнена НСТ
3.Состояние естественной цитотоксичности киллерных клеток определяли против эритромиелоидной клеточной линии К-562. Лимфоциты, выделенные из лимфатических узлов, инкубировали с меченными Сч51
клетками – мишенями при соотношении клеток-мишеней и клеток эффекторов 1:25 в течение 6- 18 часов при температуре 37 градусов С.
Учет реакции проводили измеряя радиоактивность супернатантов на счетчике у излучений /Гамма-6/. Подсчет цитотоксической активности определяли по формуле
опыт - спонтанный
% лизиса = ---------------------------------------- * 100%
максимальный - спонтанный
где опыт – удвоенное среднее значение выхода Сч51 в трех опытных лунках.
Спонтанный - среднее значение спонтанного выхода Сч51 в контрольных лунках /3/, максимальное – среднее значение уровня радиоактивности /в 100мкл меченной культуры/ мишеней.
Реакция бласттрансформации лимфоцитов отражает уровень пролиферации лимфоидных клеток в ответ на митогены. В качестве митогена использовали ФГА-Р в митогенной - 10 мкг/мл и субмитогенной дозах – 2мкг/мл. Уровень пролиферации клеток оценивали радиометрически по включению 3н – тимидина. При анализе учитывали спонтанную пролиферацию, то есть без активации, и в ответ на митогены.
Подробное описание перечисленных методов дано в книге «Иммунологические методы» под редакцией Г.Фриммелл, М, Медицина,1097 год, стр. 381-386, 387-388, 283-286, 294-302.
5. Уровень содержания интерферонов в сыворотке крови определяли по их способности подавлять размножение вируса везикулярного стоматита /штамм Индиана/ в культуре клеток фибробласто эмбрионов мышей. Используя в качестве индуктора а/в интерферонов вирус болезни Ньюкасла /ВБН/ в дозе 150 Га/мл и СТА-гамма в качестве индуктора гамма -интерферона /стафилококковый энтероксин А/, в дозе 0.01 мкг/м была изучена интерферонпродуцирующая способность иммунокомпетентных клеток. Описание метода можно найти в журнале «Иммунология» №3, 1986 год, с 52-54 и №6, 1986 год, с. 38-40.
Эксперименты были выполнены на мышах линии СВА и С57ВФ.
Весь цифровой материал, представленный в работе подвергнут вариационно-статистической обработке.
Среднее арифметическое значение показателей определяли по формуле
М= Сумма Х/ n, где М – среднее арифметическое значение, Х – числовое значение отдельных показателей или вариант, N– количество вариант, Сумма Х - сумма изучаемых вариант.
Среднюю ошибку определяли по формуле m= +- сигма/корень из n. Цифровые результаты изучаемых нами показателей представлены в виде средних арифметических значений +- средняя ошибка /М +-м/. Оценку уровней значимости полученных числовых показателей производили по Т-критерию Стьюдента ( формулу критерия мы опустили – прим ред.)
Одним из важных показателей иммунитета является активность естественных киллеров, играющих существенную роль в противоопухлевом и противоинфекционном иммунитете, поэтому определение этого показателя представляет значительный интерес при оценке воздействий, направленных на иммунную систему.
Анализ показателей активности естественных киллеров через 1-1.5 часа не выявил каких-либо изменений при воздействии ДЗУ №1 и №2. Однако, через 24 часа после воздействия ДЗУ №1 нами было зарегистрировано значительное увеличение активности этих клеток. При этом ДЗУ №2 не оказывал достоверно выраженного эффекта.
Как видно на рис.2, в первой серии экспериментов цитотоксичность естественных киллеров составила в среднем 3.06 +- 0.85%. Под влиянием ДЗУ №1 этот показатель увеличивался в 2 раза / p < 0.5 /, а под влиянием ДЗУ №2 существенных изменений по сравнением с контролем не отмечалось
/4.14 +- 0.28/.
Аналогичная закономерность наблюдалась и во второй серии экспериментов /рис. 2/, хотя эффект стимуляции был менее выражен, чем в первой серии опытов. Однако сравнительный анализ эффектов ДЗУ «1 и №2 не выявил статистически достоверной разницы, как в первой , так и во второй сериях исследований.
Итак, можно сделать вывод о том, что ДЗУ №1 обладает способностью стимулировать активность естественных киллеров.
Результаты
В настоящих исследованиях было изучено влияние однократного воздействия ДЗУ №1 и №2, обладающих различными характеристиками, в течение 10 мин. Эффект зарегистрировали через 1-1.5 часа и через сутки. Учитывая то, что нами был использован ДЗ №1, отличающийся по условиям зарядки, проведенные эксперименты были разделены на 2 серии. Это представлялось целесообразным еще и потому, что позволило учесть линейные различия используемых мышей и исключить влияние сезонных факторов. Первая серия экспериментов проводилась в весенне-летний период на мышах серии СВА, а вторая - в осенне-зимний на мышах серии С57ВI.
Анализ полученных данных свидетельствует о выраженной способности ДЗУ №1 активировать клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Уже через 1 час после воздействия ДЗУ №1 в обоих сериях экспериментов отмечается существенное увеличение количества фагоцитирующих клеток . Как видно из табл. 1, количество фагоцитирующих клеток достоверно увеличилось под влиянием ДЗУ , в первой серии на 82% / р < 0.02 /, а во второй - на 65% / р < 0.02 / по отношению к контролю. При этом действие ДЗУ №2 не вызывает значительных изменений данного показателя, который в разных сериях экспериментов составил 38.53% и 39% /в контроле соответственно 35.6 и 32.0 / р < 0.1 //. Увеличение количества фагоцитирующих клеток сопровождается активизацией их функциональной активности. Показателем этого являются показатели НСТ-тета, которые характеризуют уровень ферментативных процессов в макрофагах. Результаты, представленные в таблице , свидетельствуют о том, что под влиянием ДЗУ №1 в обоих сериях экспериментов происходит достоверное увеличение более, чем в 2 раза / р < 0.02 /, формазан положительных клеток в ЦПА.
При воздействии ДЗУ №2 достоверных изменений данного показателя не обнаружено. /табл. 1/.
Таким образом ДЗУ №1 в отличие от ДЗУ №2 по сравнению с контролем обладает выраженной способностью стимулировать макрофаги, увеличивая их как количество, так и активизируя ферментативные процессы в этих клетках. При статистическом анализе эффектов ДЗУ №1 и ДЗУ №2 достоверные отличия наблюдались только в первой серии экспериментов, что по-видимому отражает особенности зарядки ДЗУ.
Через 24 часа отмечается снижение количества и функциональной активности фагоцитирующих клеток. Динамика активности фагоцитирующих клеток представлена на рис.1
Выводы
1.Долговременное запоминающее устройство (ДЗУ) при однократном воздействии оказывает достоверный стимулирующий эффект на количество и функциональную активность фагоцитирующих клетокю
2..Метод определения функциональной активности макрофагов по поглощению частиц датекса и метод определения ферментивной активности макрофагов по восстановлению нитротетразолиевого синего – 2 метода , информативность которых для выявления эффекта ДЗУ не вызывает сомнения.
3.Под влиянием ДЗУ происходит активация функциональной активности естественных киллеров.
4.ДЗУ оказывает стимулирующее действие на продукцию интерферона иммунокомпетентными клетками и повышает его количество в сыворотке крови.
5.Эффект, оказываемый ДЗУ, зависит от индивидуальных особенностей оператора, что проявляется как в степени воздействия на функциональную активность иммуноцитов, так и в селективности воздействия на ту или иную популяцию иммуноцитов.
6. Незаряженное ДЗУ (конструкция) , как правило, оказывает стимулирующий эффект на митоген-индуцированную пролиференцию Т-лимфоцитов. Это дает основание полагать, что конструкция сама по себе обладает определенным потенциалом воздействия на иммуноциты.
Предложения
1.Считаем необходимым провести симпозиум с приглашением потенциальных спонсоров, на котором будут доложены основные данные, полученные иммунологами, генетиками и радиобиологами.
2.Полагаем необходимым провести заседание Ученого совета с приглашением всех специалистов, работающих с ДЗУф, для комплексного обсуждения полученных результатов и разработки координированной программы дальнейших исследований.
3.Полученные данные позволяют рекомендовать ДЗУ для применения в животноводстве и птицеводстве для коррекции нарушений функций иммунной системы.
4.Результаты исследования свидетельствуют о возможности применения ДЗУ в клинике для лечения больных с иммунозависимыми заболеваниями после отработки схем и методов воздействия.
ПРИЛОЖЕНИЯ
